一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质干细胞转变为汗腺样细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及人体汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在非转基因条件下，利用含汗腺细胞匀浆液的条件培养基诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺细胞的方法。
【背景技术】
[0002]皮肤被覆于身体表面，是人体最大的器官。排汗功能是其众多功能之一，可排出机体25%的热量以保持体温的相对恒定。轻度烧伤时汗腺细胞可以其深部未受创的部分为模板而完全修复，但全层大面积烧伤患者因汗腺被毁或被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，这不仅给患者的生理与心理带来严重障碍，而且对其后期的生活与工作质量将产生严重影响。因此，研究皮肤损伤后汗腺组织的修复与再生，不仅是创(烧、战)伤治疗本身的需要，而且也是重塑人体生理与心理的需要，值得人们关注。
[0003]近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，利用成体干细胞及其可塑性为皮肤附属器的再生带来了新的希望。利用骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)再生汗腺主要包括以下优点:一是MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潜能；二是MSCs存在于骨髓基质，在大面积创伤、烧伤时受到外界的直接破坏作用比较小；三是储存量比较大，在严重创伤和烧伤条件下能够发生动员，容易获取。基于以上原因，深入开展MSCs的分化调控研究对皮肤汗腺再生策略具有重要的理论意义和应用价值。
[0004]我们和他人大量的前期研究已经初步证明MSCs直接参与了皮肤损伤修复与再生的全过程，其中包括:皮肤组织损伤后，造血干细胞和间充质干细胞从骨髓动员到循环细胞池，并迁移到损伤部位。在此基础上，我们实验室又进一步开展了 MSCs向汗腺细胞诱导分化的研究工作，目前通过MSCs与热休克汗腺直接共培养技术，已成功将MSCs诱导成为汗腺细胞或汗腺样细胞。但此项技术的缺点是被诱导成为汗腺样细胞的MSCs中混杂有原始的汗腺细胞，因此影响了这项技术在临床治疗上的推广应用。为解决这一技术难题，我们发明了一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质干细胞转变为汗腺样细胞的方法。
【发明内容】
[0005]因此，本发明提供了一种汗腺细胞匀浆液诱导骨髓间充质于细胞转变为汗腺样细胞的非转基因方法，包括以下步骤:
[0006]a)分离并培养MSCs，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白⑶29、⑶44和CD105 ；
[0007]b)分离并培养汗腺细胞，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和 CK19 ；
[0008]c)将上述培养的汗腺细胞通过超声波法进行匀浆处理，之后离心去除细胞杂质，使之形成含汗腺匀浆液的条件培养基；
[0009]d)使用上述含汗腺匀浆液的条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞的转分化；
[0010]优选地，含汗腺匀浆液的条件培养基，浓度为I X 15个细胞匀浆液/ml。
[0011]优选地，诱导时MSCs的细胞密度为3X105/ml。
[0012]优选地，MSCs向汗腺细胞转分化的诱导时间为8天。
【附图说明】
[0013]图1描述了免疫细胞化学法检测MSCs表面标志性蛋白⑶29、⑶44和⑶105的表达。其中(A)为空白对照；(B)为 CD29 ； (C)为⑶ 105 ； (D)为 CD44 ;bar=100um。
[0014]图2描述了免疫细胞化学法检测汗腺细胞表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19的表达。其中(A)为 CEA ； (B)为 CK7 ； (C)为 CK8 ； (D)为 CK19 ;bar=100um。
[0015]图3描述了 MSCs转分化诱导后细胞形态的改变。其中(A)为MSCs诱导前的形态；(B)为MSCs诱导后4天的形态；(C)为MSCs诱导后8天的形态；(D)为正常汗腺细胞的形态；bar=100umo
[0016]图4描述了 MSCs转分化诱导8天后细胞表型的改变。其中(A，B)为诱导前后CEA的表达；(C，D)为诱导前后CK7的表达；(E，F)为诱导前后CK8的表达；(G，H)为诱导前后CK19 的表达；bar=10um。
【具体实施方式】
[0017]以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例是为了阐述发明，而非限定发明的范围。
[0018]实施例
[0019]实施例1MSCs的分离培养及鉴定
[0020]无菌条件下取正常志愿者的髂骨骨髓约2ml，采用直接贴壁法，以含10%胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(lOOyg/ml)的DMEM为培养液，在37°C、5% C02孵育箱内培养，24h后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每2?3d换液I次。待细胞达80%融合时，用0.125%的胰蛋白酶消化，给予传代培养和组化检测。取细胞爬片，用预冷的甲醛丙酮混合液(体积比1:1))固定30min，按二步法免疫组化检测试剂盒说明分别进行⑶29、⑶105和CD44的免疫细胞化学染色，以PBS代替一抗作为空白对照。
[0021]免疫细胞化学检测结果表明:上述从人骨髓分离培养的细胞，均表达CD29(图1B)和⑶105 (图1C)，高表达⑶44 (图1D)，而空白对照组无阳性细胞出现。说明此细胞为骨髓间充质干细胞，而且纯度较高。
[0022]实施例2汗腺细胞的分离培养及鉴定
[0023]取约0.13cmX2.1Ocm的全层正常皮肤，置于含有青霉素(100U/ml)和链霉素(ΙΟΟμ g/ml)的人平衡盐溶液中反复漂洗，去除皮下脂肪，在60mm2培养皿中将皮肤剪成Imm3左右的小块，加入含有II型胶原酶(2mg/ml)、胎牛血清(5% )、青霉素(100U/ml)和链霉素(100yg/ml)的DMEM液3ml，置37°C、5% C02、95% 02、饱和湿度孵箱中过夜。次日在清洁的、紫外线消毒的50X倒置相差显微镜下挑取汗腺组织，置37°C、5% C02,95% 02、饱和湿度条件下培养。汗腺培养液以DMEM作为基础培养液，补加胎牛血清(5%)、重组人表皮生长因子(10ng/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2ng/ml)、半琥珀酰氢化可的松(0.14 μ g/ml)、胰岛素2转铁蛋白2亚硒酸钠(lml/100ml)(以上试剂均购于Gibco)及青霉素(100U/ml)、链霉素(100 μ g/ml)。待人汗腺细胞贴壁后，补加约2ml汗腺培养液继续培养，以后每2?3d换液一次。待细胞达80%融合时，用0.125%胰蛋白酶消化，给予爬片检测。按前述的细胞固定及免疫细胞化学法行CEA、CK7、CK8和CK19检测。
[0024]免疫细胞化学检测结果表明:上述从人皮肤分离培养的细胞，均表达CEA (图2A)、CK7 (图2B)、CK8 (图2C)和CK19 (图2D)。说明此细胞为汗腺细胞，而且纯度较高。
[0025]实施例3将上述培养的汗腺细胞进行匀浆获得含汗腺细胞匀浆液的条件培养基
[0026]原代培养的汗腺细胞达70%?80%融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化后，制成细胞悬液进行细胞计数，并加入新的DMEM基础培养液调整细胞浓度为I X 105/ml，然后利用超声波细胞粉碎机将细胞匀浆，离心去除细胞杂质，收集上清即获得含汗腺细胞匀浆液的条件培养基，放_80°C保存备用。
[0027]实施例4含汗腺细胞匀浆液的条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞的转分化
[0028]将MSCs于诱导前一天以3X 105/ml的密度接种于60_2的培养皿中，次日进行转分化诱导。对照组使用新鲜的DMEM细胞培养基，实验组使用含汗腺细胞匀浆液的条件培养基，诱导时间为8天。所有实验均重复至少3次。
[0029]1.MSCs转分化诱导后细胞形态的改变:MSCs诱导前体积较大，呈纤维状分散性分布(图3A);诱导4天后细胞体积变小，呈多边形且比较扁平，部分细胞可相互连接成片(图3B);诱导8天后细胞进一步连接成片，如“铺路石”样生长(图3C)，形态类似汗腺上皮细胞(图 3D)。
[0030]2.MSCs转分化诱导后细胞表型的改变:MSCs经热休克汗腺条件培养基诱导8天后，按前述的细胞固定及免疫细胞化学法行CEA、CK7、CK8和CK19检测。结果显示:被诱导的细胞中有50-70%的细胞呈CEA (图4B)、CK7 (图4D)、CK8 (图4F)和CK19(图4H)染色阳性。而对照组没有检测到CEA (图4A)、CK7 (图4C)、CK8 (图4E)和CK19 (图4G)染色阳性的细胞。
[0031]以上结果说明:经过建立适当的体外汗腺诱导培养体系，中胚层的MSCs可以通过跨胚层转分化途径转变为汗腺样细胞，并且从形态、表面标志等方面确证这些转分化来源的细胞为汗腺细胞。
【主权项】
1.分离并培养骨髓间充质干细胞(MSCs)，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD29、CD44 和 CD105。
2.分离并培养汗腺细胞，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19。
3.将上述培养的汗腺细胞计数，并通过超声波法进行匀浆处理，之后离心去除细胞杂质，使之形成含汗腺匀浆液的条件培养基，浓度为IX 15个细胞匀浆液/ml。
4.使用上述含汗腺匀浆液的条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞转分化，诱导时MSCs的细胞密度为3X 105/ml，诱导8天后获得汗腺样细胞。
【专利摘要】本发明涉及人体汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在体外培养条件下，通过含汗腺匀浆液的条件培养基，诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺样细胞的方法。
【IPC分类】C12N5-0775, C12N5-071
【公开号】CN104651303
【申请号】CN201310585168
【发明人】张翠萍, 付小兵
【申请人】中国人民解放军总医院第一附属医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月16日