一种用磷酸盐扩增γδT细胞的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用磷酸盐扩增Y ST细胞的方法及其应 用。
【背景技术】
[0002] T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体（T cell rec印tor，TCR)的不同分为两类： TCRa PT细胞和TCRyST细胞，分别简称为a PT细胞和Y ST细胞。Y ST细胞具有 特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视 的第一道防线。如何高效、快速地在体外大量扩增人外周血Y ST细胞，对于yST细胞 免疫功能的研究、提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力非常重要，但由于Y ST细胞在 外周血和肿瘤组织中含量不高，一般不超过T细胞总数的5%，要获得大量高细胞毒活性的 Y ST细胞是十分困难的。
[0003] 授权公告号为CN1306027C的发明专利提供了一种体外扩增YST淋巴细胞的方 法，该方法采用固相抗Y STCR抗体选择性扩增yST细胞，但是其使用的抗ySTCR抗体 较贵，生产成本太高。
[0004] 授权公告号为CN102533649B的发明专利提供了一种简单高效制备人ys T细胞 的方法，该方法采用结核杆菌耐热性抗原联合细胞因子人重组rhIL-2及人重组rhIL-21刺 激扩增Y ST细胞，但该法获得的yST细胞的特异性克隆占优势，但普适性较差，不能广 泛杀伤不同类型的肿瘤。
[0005] 因此有必要提供一种高效、低成本的对肿瘤具有广泛杀伤能力的YS T细胞的制 备方法。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种体外扩增人YST细胞的方法，该体外扩增 人Y S T细胞的方法采用（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐以及人重组 白细胞介素rhIL-2刺激单个核细胞，从而扩增其中的Y 5 T细胞；该方法成本低、操作流程 简单、且能在较短时间内获得具有广泛杀伤性的Y ST细胞；本发明还提供了该体外扩增 人Y ST细胞的方法的应用。
[0007] 本发明所述" Y S T细胞"是指T淋巴细胞受体（TCR)由Y和S链构成的淋巴细 胞；本发明所述"单个核细胞"是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。
[0008] 第一方面，本发明提供了一种体外扩增人YST细胞的方法，包括如下步骤：（1) 制备或提供单个核细胞；（2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以 及（3)收获培养后的细胞，所述细胞培养液中含有（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二 膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。
[0009]优选地，所述细胞培养箱的条件设置为37°C，5%C02。
[0010] 优选地，所述（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐（IBA)在细胞培 养液中的摩尔浓度为〇. 5 ii M~2. 0 i! M。
[0011] 优选地，所述人重组白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10~100U/ml。
[0012]本发明提供的细胞培养液中rhIL-2的浓度为10~100U/ml是本发明的优选范 围，根据需要，可以适当加大rhIL-2在细胞培养基中的浓度，比如采用含100~500U/ml的 rhIL-2的细胞培养液。
[0013] 在本发明技术方案的细胞培养液中选用人重组白细胞介素rhIL-2。其他来源的 IL-2 (比如直接从动物体内提取的IL-2)可做为人重组白细胞介素rhIL-2的替代品，但用 来扩增人Y ST细胞可能会引起免疫反应，是较差效果的选择。
[0014] 优选地，所述树突状细胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5~20。
[0015] 进一步优选地，所述树突状细胞为所述单个核细胞的0. 1倍。
[0016] 优选地，所述细胞培养的过程中，每2~3天进行半量更换培养液。
[0017] 优选地，所述细胞培养的时间为8~14天。
[0018] 进一步优选地，所述细胞培养的时间为8天。
[0019] 优选地，所述单个核细胞来源于人的外周血。
[0020] 优选地，所述细胞培养液为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗。其中，RPMI-1640购自 gilco公司，FBS为牛胎血清，双抗为链霉素和青霉素。
[0021] 优选地，所述细胞培养液中含有10%~15%的牛胎血清（FBS)或10%~15%的人 血清。
[0022] 进一步优选地，所述细胞培养液中含有10%的牛胎血清（FBS)或10%的人血清。
[0023] 本发明采用含10%~15%FBS的培养细胞液是本发明的优选范围，此外，可以根据 需要调整细胞培养液中血清的浓度，比如培养液采用15%以上的血清浓度。
[0024] 可选地，人血清为分离PBMC所收集的血清，该血清需要56°C灭活30min以去除血 清中补体等对热敏感的物质。
[0025] 本发明采用rhIL-2以及（1-羟基_3_(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐(伊 班膦酸钠，IBA)联合刺激PBMC，能快速、简便、低成本扩增得到yST细胞。其中，rhIL-2 是T细胞生长因子，能使T细胞在试管内长期存活，并刺激T细胞进入细胞分裂周期，此外， rhIL-2能诱导T细胞分泌IFN-y、TNF、CSF等细胞因子，增强T细胞的杀伤活性；IBA属于 非肽类的小分子磷酸化合物，而人Y ST细胞能直接对非肽类配体起反应，表现为细胞毒 性和细胞因子产生。
[0026] 本发明采用IBA利用与结核杆菌耐热性抗原不同的机制选择性激活Y S T细胞， 能丰富扩增后Y ST细胞的亚群种类，激活的yST细胞呈多克隆化，其TCR具有更丰富 的⑶R3克隆，对肿瘤的杀伤能力更具普适性；与只添加了 rhIL-2的对照组相比，rhIL-2和 IBA的联合使用使得肿瘤杀伤的细胞因子表达量上升，rhIL-2和IBA的联合使用比单纯使 用rhIL-2对yST细胞的扩增效率更高，扩增得到的yST细胞对肿瘤的杀伤力更强，具 有广泛靶向各种肿瘤的能力。
[0027] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述体外扩增人Y S T细胞的方法在制备预 防或治疗癌症的药物中的应用。
[0028] 本发明提供了的体外扩增人Y S T细胞的方法及其应用具有如下有益效果：
[0029] (1)本发明采用rhIL-2和IBA联合刺激进行体外扩增人Y S T细胞的方法，相比 仅采用rhIL-2刺激的方法，本发明所得yS T细胞的扩增效率更高；
[0030] (2)本发明提供的体外扩增人Y S T细胞的方法能得到TCR多样性更丰富，肿瘤的 杀伤性更广泛的人Y ST细胞；
[0031] (3)本发明提供的体外扩增人Y S T细胞的方法成本低、扩增效率高、耗时短且制 备流程简单。
【附图说明】
[0032] 图1~图4为本发明实施例2所提供的样品的流式细胞数据二维散点图；
[0033] 图5为本发明实施例3所提供的样品的CCR5表达水平检测结果；
[0034] 图6为本发明效果实施例所提供的样品的肿瘤细胞杀伤实验结果。
【具体实施方式】
[0035] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0036] 本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。
[0037] 实施例1
[0038] 本实施例提供了一种分离人外周血单个核细胞即PBMC的方法，包括如下步骤：
[0039] (1)无菌采集血液至肝素抗凝管中；
[0040] (2)取淋巴细胞分离液加入15ml离心管管底，将离心管倾斜45°角，用吸管吸取 血液样品(分离液体积：血样体积=1:2)，小心加入分离液上lcm处，沿离心管管壁缓慢地将 血样叠加到分离液上，勿破坏分离液层界面；
[0041] (3)室温400g水平离心20min，缓慢升降速；
[0042] (4)平稳取出离心管，此时最下层是红细胞和粒细胞，中间层是淋巴细胞分离液， 最上层是血浆、稀释液等。血浆层与分离液交界处浑浊灰白色层（白膜层)，富含单个核细 胞。
[0043] (5)小心吸取上层血浆(约1/2体积)至另一干净离心管中，56°C灭活30min，1000g 离心10min，保留上清，放置于4°C冰箱备用。
[0044] (6)用吸管轻轻吸取白膜层细胞，放入另一 15ml离心管中。加入适量PBS，室温 200g离心10min，弃上清，重复三遍，尽量除去血小板。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例提供了一种体外扩增Y S T细胞的方法，包括如下步骤：
[0047] ( 1)设计对照组和实验组，实验组分为3组；对照组和实验组1~3组培养基中 均加入10U/ml的rhIL-2,其中，实验组1~3组的培养基中分别加入0. 511|1、1.〇111和 2. 0iiM 的 IBA ;
[0048] (2)取含有500iiL培养基的24孔板、实施例1得到的外周血单个核细胞PBMC，其 中，对照组和实验组每孔加入2X105的PBMC;所用培养基为RPMI-1640+15%FBS+1%双抗；
[0049] 根据步骤（1)和步骤（2)，得出对照组和各实验组设计如下表1 :
[0050]
【主权项】
1. 一种体外扩增人Υ δτ细胞的方法，包括如下步骤：（1)制备或提供单个核细胞； (2)将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3)收获所述培养后的 细胞，其特征在于，所述细胞培养液中含有（1-羟基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单 钠盐以及人重组白细胞介素 rhIL-2。
2. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述（1-羟 基-3-(甲基戊基氨基）丙叉）二膦酸单钠盐在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μ M~ 2· O μ Μ。
3. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δΤ细胞的方法，其特征在于，所述人重组白 细胞介素 rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10~100U/ml。
4. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法，其特征在于，所述树突状细 胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5~20。
5. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养 的过程中，每2~3天进行半量更换培养液。
6. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养 的时间为8~14天。
7. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法，其特征在于，所述单个核细 胞来源于人的外周血。
8. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法，其特征在于，所述细胞培养 液中含有10%~15%的牛胎血清或10%~15%的人血清。
9. 如权利要求1所述的一种体外扩增人Y δ T细胞的方法在制备预防或治疗癌症的药 物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法及其应用。所述体外扩增人γδT细胞的方法包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获所述细胞；所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。本发明采用rhIL-2和IBA联合刺激人外周血单个核细胞（PBMC）的方法在体外扩增人γδT细胞，该方法成本低、制备简单、扩增效率高，且能得到肿瘤杀伤力强、TCR克隆多样的γδT细胞。
【IPC分类】A61K35-17, A61P35-00, C12N5-0783
【公开号】CN104651308
【申请号】CN201310596715
【发明人】金言, 党利君, 胡玉婷, 张茜, 任广慧, 万晓春
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月22日