冬虫夏草ctp合成酶、编码基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一个来自"百令"生产菌冬虫夏草中国被毛孢的参与三磷酸尿苷出发 合成代谢三磷酸胞苷的CTP合成酶（CTPsynthase)，编码这个酶的基因及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 冬虫夏草（Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫（Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸 体上的复合体（包括子座和虫体）。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产 物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其 多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾 二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳瘘遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳 痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏 草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物 活性。
[0003] 冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段（无性型）和子囊孢 子阶段（有性型）。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草 菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、 活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证 明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。
[0004] 天然虫草具有严格的寄生性以及特殊的生态环境，故其产量很低，价格高昂。野生 冬虫夏草由于受生长环境等因素制约，资源匮乏。由于近几年在人工栽培上进展不大，野生 冬虫夏草代用品研宄多集中在液体发酵上。利用液体深层发酵培养冬虫夏草菌丝体、提取 物或发酵液，是解决冬虫夏草药源的一种有效途径。虫草发酵生产虫草替代品，既可有效 保护虫草这一珍贵资源，又不受气候、地理环境和虫草寄生条件严格的限制，适合于工业化 大规模生产。生产出的替代品如菌丝体其成分和药效也与天然虫草相似，因而国内外一直 致力于虫草菌丝体的发酵培养。人工发酵培养冬虫夏草中国被毛孢得到的菌丝，经毒理、药 理、植化研宄，证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可代替天然虫草生产虫草制 品，以弥补自然资源的短缺，通过对发酵条件的优化，菌丝体生物量和代谢产物的量均有明 显提尚。
[0005] 近年来，随着天然产物化学和现代色谱技术的飞速发展，在对虫草产品研发中已 逐步由虫草原料或粗提物的直接利用转向更深层次的功能性代谢产物研宄。国内外已对虫 草代谢产物做了大量的研宄，代谢产物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等几大类化合物，其 中嘌呤类核苷、虫草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代谢产物在生物合成、药理作用等 方面的研宄初见成效。
[0006] 核苷类是虫草最主要的活性物质之一，其中嘧啶类核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶 核苷。尿喃啶核苷（uracil riboside)又称尿苷（ulidine)，别称由雪核糖苷、二氢喃啶核 苷、1-0-D-喃核糖基尿喃啶。胞喃啶核苷（cytosine riboside)又名胞苷（cytidine)、胞 啶、1-0 -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作为保健品和食品的添加剂。 它作为美容和抗紫外辐射化妆品也逐渐成为人们生活的必需品，作为药物，已临床应用于 中枢神经、泌尿、代谢和心血管等多方面的疾病，在美国，核酸类药品近年来在抗病毒、抗肿 瘤方面显示了不可替代的作用。
[0007] 由于嘧啶核苷及其类似物的重要生理作用，国内外有关微生物生产嘧啶类核苷已 有很多研宄。然而作为重要合成代谢嘧啶类核苷的冬虫夏草菌，还只停留在代谢产物成分 分析和功效的研宄上，对冬虫夏草菌嘧啶类核苷合成代谢途径中相关基因和蛋白的研宄还 很少见。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于针对以上存在的不足和需要解决的技术问题，对"百令"生产菌冬 虫夏草中国被毛孢合成代谢三磷酸胞苷的酶及其编码基因进行深入研宄，提供了"百令"生 产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三磷酸尿苷出发合成代谢三磷酸胞苷的酶、编码基因及其应 用。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明涉及一种来自"百令"生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三磷酸尿苷出发合 成代谢三磷酸胞苷的CTP合成酶，所述酶具有SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示氨基酸序 列90%以上同源性，优选序列为SEQ ID No. 1的pynKl蛋白或序列为SEQ ID No. 2的pynK2 蛋白；该酶可催化三磷酸尿苷制备三磷酸胞苷。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性 片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上， 均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或 替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性 质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0011] 由三磷酸尿苷合成代谢获得三磷酸胞苷的路径如下：
【主权项】
1. 一种冬虫夏草CTP合成酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。
2. 如权利要求1所述冬虫夏草CTP合成酶在生物催化三磷酸尿苷制备三磷酸胞苷中的 应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含冬虫夏草CTP合成酶菌 体发酵培养获得的湿菌体经细胞破碎后的破碎混合液为催化剂，以三磷酸尿苷为底物，于 pH为6. 5~8. 5的缓冲溶液构成的转化体系中，在30°C、150rpm条件下转化反应2~3h， 反应结束后，将反应液过滤，取滤液即为含三磷酸胞苷的粗品，所述粗品分离纯化获得三磷 酸胞苷。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为10g/L，所述催化剂的 体积用量为lOOmL/g底物，所述催化剂的干菌体浓度为6. 7mg/mL。
5. -种编码权利要求1所述酶的基因。
6. 如权利要求5所述基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示。
7. 如权利要求5~6之一所述基因在构建能够生物催化三磷酸尿苷制备三磷酸胞苷的 基因工程菌中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述冬虫夏草CTP 合成酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行 诱导培养，培养液分离纯化获得含有冬虫夏草CTP合成酶的菌体细胞。
【专利摘要】本发明涉及一个来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与三磷酸尿苷出发合成代谢三磷酸胞苷的CTP合成酶，编码这个酶的基因及其应用；所述CTP合成酶，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列90％以上同源性，其编码基因具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列90％以上同源性；本发明从原理上对三磷酸尿苷合成三磷酸胞苷的代谢途径进行了详细研究，包含本发明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节三磷酸胞苷生物合成基因的表达，赋予宿主三磷酸胞苷的高表达性，为扩大三磷酸胞苷的产量提供了有效途径，具有重大应用前景。
【IPC分类】C12R1-19, C12P19-30, C12N9-00, C12N15-52, C12N1-21, C12N15-70
【公开号】CN104651324
【申请号】CN201510023806
【发明人】郑裕国, 柳志强, 吴晖, 李邦良, 许静, 吴玲芳, 许峰, 薛亚平, 袁水金, 王鸿艳
【申请人】浙江工业大学, 杭州中美华东制药有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2012年12月10日