用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的q-pcr引物、鉴定方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明分子生物学检测领域，具体地涉及用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的Q-PCR 引物、鉴定方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 日本血吸虫病是一种严重危害人体健康的人兽共患寄生虫病，预防日本血吸虫感 染是当前公共卫生最为重要的工作之一，据2011年全国血吸虫病疫情通报显示，全国推算 血吸虫病人286836例，其中晚期血吸虫病患者30028例。有效防控疫区血吸虫感染对经济 社会稳定至关重要。
[0003] 钉螺是日本血吸虫唯一的中间宿主，在我国长江流域分布较广，尤其是湖南、湖 北、江西、安徽、江苏等省，其对血吸虫的传播与疫区血吸虫病的流行起到关键的作用，在血 吸虫病传播与防治及公共卫生方面有重要价值，因此，能够对长江流域钉螺的鉴定，可以直 观的反映血吸虫病流行区的流行状况，更好的指导日本血吸虫病防控。
[0004] 目前，阳性钉螺的鉴定方法主要以压碎螺体、显微镜下观察是否有蝴体为判定标 准。此方法对技术人员要求较高，而且准确率较低，容易出现鉴别错误；而钉螺感染后，由于 血吸虫发育需要时间，显微镜检最早的时间在9天，特别是现场采集的钉螺，也需要在实验 室饲养一段时间，才能够通过显微镜判定，时效性太差，不能满足当前血防工作的需求。
[0005] 因此，需要开发一种简单方便、人为因素干扰少的能够快速、准确鉴别阳性钉螺的 方法。
【发明内容】
[0006] 发明目的：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种日本血吸虫感染钉螺 鉴定用Q-PCR引物、鉴定方法与试剂盒，可以能够快速、准确鉴别阳性钉螺，具有简单方便、 人为因素干扰少的优点。
[0007] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供一种用于鉴定日本血吸虫感染钉螺 的Q-PCR引物，其特征在于，所述Q-PCR引物为：
[0008]上游引物PF:5 ' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3 '
[0009]下游引物PR: 5' -AITCGGGTGITCTTGAGGCT-3 '。
[0010] 本发明进一步提出了利用权利要求1所述的引物鉴定日本血吸虫感染钉螺的方 法，包括如下步骤：
[0011] (1)抽提总RNA;
[0012] (2)逆转录：日本血吸虫基因的序列如SEQNO1所示，利用试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA;所述试剂盒为商品化试剂盒（ThermoScript?RT-PCRSystem，Cat no. 11146-024)，包括trizol、dNTP、逆转录酶、PCR反应缓冲液等；
[0013] (2)Q-PCR扩增：以步骤⑵中的cDNA为总DNA为模板，利用权利要求1所示的 Q-PCR引物采用试剂盒（GeneCoreCatNo. 106-8758-1)进行PCR扩增，采用荧光定量PCR仪器进行检测，根据扩增曲线在25个循环以下（即Ct值小于25)出现上升峰，扩增产物为 274bp即判定为阳性。
[0014] 其中，步骤（2)中，Q-PCR反应的扩增体系为：2~10ng/ul的模板DNA25ul ;上游引 物和下游引物浓度均为lug/ul，各lul ;PCR反应缓冲液；10XSYBE Green染料5ul，5XNTP 10ul，加水至50ul总反应体积。
[0015] 步骤⑵中，Q-PCR反应的程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性45s， 72°C延伸30s，总共40个循环，最后72°C延伸7min。
[0016] 步骤（2)中，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQN0 2所示。
[0017] 本发明进一步提出了一种用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的试剂盒，该试剂盒包括 权利要求1所述的Q-PCR引物。
[0018] 本发明还提出了上述Q-PCR引物或上述的试剂盒在日本血吸虫感染钉螺鉴定中 的应用。
[0019] 有益效果：与现有技术相比，本发明利用日本血吸虫特有的A基因序列合理设计 PCR引物，结合逆转录和PCR扩增以及扩增曲线判读，鉴定钉螺是否为日本血吸虫阳性感 染，具有操作简单、程序化高、鉴定快速和结果准确等优点，避免传统显微镜下解剖鉴定方 法耗时耗力、可重复性差和人为干扰因素大等缺点。
【附图说明】 图1为实施例1Q-PCR扩增曲线的示意图； 图2为凝胶电泳检测结果的示意图。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1日本血吸虫感染钉螺的鉴定方法。
[0021] 实验室饲养钉螺共100只，其中人工感染钉螺50只，未感染对照50只。应用 Trizol结合RNA提取试剂盒抽提总RNA ;
[0022] 利用存在于日本血吸虫的A基因序列合理设计一对Q-PCR引物，Q-PCR引物序列 为：
[0023]上游引物PF:5 ' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3 '
[0024]下游引物PR:5 ' -AITCGGGTGTTCTTGAGGCT-3。
[0025] 其中，A基因的序列为SEQN01所示，其是根据人的基因序列设计引物在虫上克隆 出的，克隆所用引物为：
[0026]上游引物PF :5' -tcagAAGCTT ATGGGGCGTACTGATACATTTG-3'；
[0027]下游引物PR :5' -actg AGATCT TTATAATCCCCGAGTTAGTAAG-3'；
[0028] 克隆的产物长度为950bp，经验证该序列确实存在且序列正确。
[0029]利用试剂盒（ThermoScript?RT-PCRSystem，Catno. 11146-024,包括trizol、 dNTP、逆转录酶、PCR反应缓冲液等）用一步法将总RNA逆转录为cDNA，以上述cDNA 为总DNA模板，利用Q-PCR引物进行扩增，扩增体系为：采用试剂盒（GeneCoreCat No. 106-8758-1)，Q-PCR反应的扩增体系为：10ng/ul的模板DNA2ul;上游引物和下游引 物浓度均为 200nM，各 2ul;SYBRGreenPCRMasterMix反应缓冲液（2X)10ul;ddH20 4ul20ul总反应体积，其反应的程序为：95°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性45s，72°C延 伸30s，总共40个循环，最后72°C延伸7min。
[0030] 根据扩增曲线以及Ct值计算判断钉螺感染与否，扩增曲线的Ct值在15和25之 间，都是为有效扩增，若Ct值大于25,则没有特异性的扩增，PCR阴性；若Ct值小于25,则 判定为阳性感染螺（如图1所示）。根据琼脂糖凝胶电泳，在泳道内显示一条核苷酸序列为 274bp特异性条带，鉴定结果与显微镜检测结果一致，见表1。
[0031] 表1实验室感染钉螺检测结果
[0032]
[0033] 实施例2
【主权项】
1. 一种用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的Q-PCR引物，其特征在于，所述Q-PCR引物为： 上游引物 PF :5' -GGTCCATGTTTGGGTGGAGT-3' 下游引物 PR :5' -ATTCGGGTGTTCTTGAGGCT-3'。
2. -种利用权利要求1所述的引物鉴定日本血吸虫感染钉螺的方法，其特征在于，包 括如下步骤： (1) 抽提总RNA ; (2) 逆转录：日本血吸虫基因 A的序列如SEQ NO 1所示，利用逆转录试剂盒将总RNA逆 转录为cDNA ; (2) Q-PCR扩增：以步骤（2)中的cDNA为总DNA为模板，利用权利要求1所示的Q-PCR 引物进行PCR扩增，采用荧光定量PCR仪器进行检测，根据扩增曲线在25个循环出现上升 峰，扩增产物为274bp即判定为阳性。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，Q-PCR反应的扩增体系为： 10ng/ul 的模板 DNA2ul ;200nM 上游引物 2ul ;200nM 下游引物 2ul ;2XSYBR Green PCR Master Mix反应缓冲液IOul ;ddH20 4ul ;加水至20ul总反应体积。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，Q-PCR反应的程序为：95°C预 变性5min，94°C变性30s，60°C复性45s，72°C延伸30s，总共40个循环，最后72°C延伸7min。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)中，所述扩增产物的核苷酸序列 如SEQ NO 2所示。
6. -种用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的 Q-PCR引物。
7. 权利要求1所述的Q-PCR引物或权利要求6所述的试剂盒在日本血吸虫感染钉螺鉴 定中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种用于鉴定日本血吸虫感染钉螺的Q·PCR引物，同时提出了利用该引物鉴定日本血吸虫感染钉螺的方法。本发明利用日本血吸虫特有的A基因序列合理设计PCR引物，结合逆转录和PCR扩增以及扩增曲线判读，鉴定钉螺是否为日本血吸虫阳性感染，具有操作简单、程序化高、鉴定快速和结果准确等优点，避免传统显微镜下解剖鉴定方法耗时耗力、可重复性差和人为干扰因素大等缺点。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104651489
【申请号】CN201410781275
【发明人】黄玉政, 刘坤
【申请人】江苏省血吸虫病防治研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月16日