一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表 达量的检测方法。
【背景技术】：
[0002] 痛风是一种与遗传有关的长期嘌呤代谢障碍或尿酸排泄障碍，导致血尿酸持续增 高和尿酸盐结晶沉积，引起组织损伤的一组临床综合征。痛风性关节炎是慢性高尿酸血症 形成的尿酸结晶在关节腔内沉积而引发的关节炎，是痛风的最重要病症。随着人们生活方 式的改变，痛风在我国发病率不断上升，南方和沿海经济发达地区发病率尤高，因此越来越 受到医学界的重视。痛风引起的不可逆的关节破坏和功能障碍给人们的健康带来了极大的 危害。痛风不仅能引起关节肿胀，而且可诱发和加重脂代谢紊乱、糖尿病及心血管疾病等， 增加心脑血管疾病、代谢综合征及肾脏疾病病人的病死率。因此，痛风已成为严重威胁人类 健康的常见病、多发病。近年来，随着人们生活水平的提高，高尿酸血症的患病率越来越高， 而痛风的发病率也同样有明显的升高，但目前临床尚缺乏有效的治疗药物，亟需更多的研 究进一步研究分析痛风的发病机制和检测方法。
[0003] 目前痛风最准确的检测方法为关节滑液或痛风石的抽吸物中的尿酸盐晶体检测， 偏振光显微镜下表现为负性双折光的针状或杆状的单钠尿酸盐晶体，是当前检测痛风不可 替代的金标准，急性发作期，单钠尿酸盐晶体可见于关节滑液中白细胞内、外，也可见于痛 风石的抽吸物中；在发作间歇期，单钠尿酸盐晶体也可见于曾受累关节的滑液中，但是尿酸 盐晶体检测不仅会带给患者创伤和较重的疼感，而且关节滑液的穿刺吸取比较困难，所以， 痛风的分子生物学研究日益受到国内外的重视，需要敏感而特异性的无创性的血清学指 标，从分子水平上提高对痛风的检测水平。
[0004] MicroRNAs (miRNAs)是一类分布广泛的非编码的单链小分子RNA，其通过对mRNA 降解或抑制其翻译，在转录后对靶基因的表达水平进行调节，从而参与细胞分化、生长、凋 亡、代谢等功能。目前研究证实miRNAs在很多疾病中具有重要作用，而且与一些炎症性疾 病的发病紧密相关。研究表明，机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能导致特定疾 病状态下某些血清miRNAs表达水平的升高或降低。近年来发现血清中存在大量丰富且稳 定的miRNAs,通过对患者血清中miRNAs表达谱与对照组进行对比分析，发现不同疾病中具 有特定的表达谱，可为疾病的无创性早期检测提供一条新的途径。miRNAs在血液中可长期 稳定存在，反复冻融、长期保存等各种处理方法均不会造成血清miRNAs的损失，而外周血 标本的获得却十分简便，在血液中检测出痛风特异性的miRNAs并将其作为痛风的生物学 标志具有重要的意义，目前还未见有关痛风血清miRNAs的公开报道。因此，提供一种痛风 血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法，确定痛风miRNAs表达谱，筛选痛风特异表 达的miRNAs，建立血清miRNAs诊断模型，有助于实现对痛风的无创准确诊断及早期治疗。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供提供一种痛风血清 miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法，建立痛风血清miRNAs表达谱，揭示血清miRNAs 对痛风检测的价值，为临床上痛风患者的无创准确诊断提供支持。
[0006] 为了实现上述目的，本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物包括上调表 达的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449 和hsa-miR-4531 以及下调表达的hsa_miR-451a、 hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589_5p和hsa-miR-885_5p。
[0007] 本发明涉及的痛风血清miRNAs为来自外周静脉血的血清。
[0008] 本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片 等工具。
[0009] 本发明涉及的痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测方法如下：
[0010] (1)逆转录：采用逆转录试剂盒和miRNAs特异性莖环结构逆转录引物进行miRNAs 逆转录反应，反应体系包括3uL5*的逆转录引物、1.5uL10*的逆转录缓冲液、0. 20uL的 RNA抑制剂、0. 15uL100mmol/L的dNTP和dTTP混合物、luL逆转录酶，每个反应体系中加入 9. 15uLRNA，总反应体系为15uL;该方法的反应条件为：16°C反应30分钟，42°C反应30分 钟，最后85 °C孵育5分钟；
[0011] (2)实时荧光定量PCR:反应体系包括：0.25uL20*miRNA检测探针、2.5uL 2*MasterMix、1.25uL双蒸水、luL稀释后的cDNA，共5uL，每个miRNA检测实施3平行；使 用八81?1^81117900荧光定量？〇?仪检测，其反应条件：951：10分钟、951：15秒、601：1分 钟，以上阶段进行40个循环，完成对痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测。
[0012] 本发明采用microRNA Microarray芯片对急性痛风性关节炎、单纯高尿酸血 症及健康对照者血清标本的miRNAs表达谱进行高通量的对比分析，筛选出20个候选 miRNAs，然后采用预先设计的反转录引物和前向反向检测引物，通过逆转录-实时荧光定 量PCR (RT-PCR)方法，扩大样本量对20个候选miRNAs在痛风性关节炎及对照者血清中的 表达丰度进行验证，建立痛风特异血清miRNAs表达谱；然后采用ROC (Receiver Operator Characteristic Curve)分析方法评价血清miRNAs表达谱对于痛风患者的早期诊断以及 不同临床分级、分期的痛风患者的诊断价值。
[0013] 本发明与现有技术相比，涉及的用于检测痛风的生物标志物hsa-miR-3146、 hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、hsa-miR-589_5p和 hsa-miR-885-5p作为血清重要的生物学检测指标，在痛风临床早期准确诊断有重要价值， 为以后从分子水平诊断痛风及痛风血清miRNAs的研究提供了理论依据，具有重大的理论 意义和潜在的实用价值。
【附图说明】：
[0014] 图1为本发明实施例涉及的miRNAs在急性痛风病例和单纯高尿酸血症对照血清 中的表达差异谱。
[0015] 图2为本发明实施例涉及的miRNAs在急性痛风病例和健康对照血清中的表达差 异谱。
[0016]图3为本发明实施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531和 hsa-miR-4654在痛风病例和健康对照血清中的表达。
[0017] 图4为本发明实施例涉及的hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-361-5p、 hsa-miR-589_5p和hsa-miR-885_5p在痛风病例和健康对照血清中的表达。
[0018]图5为本发明实施例涉及的hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、 hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p对痛风的诊断ROC曲 线。
【具体实施方式】：
[0019] 下面通过实施例并结合附图对本发明进行详细说明，实施例中未注明的条件和方 法等均按照常规条件进行。
[0020] 本实施例将痛风血清miRNAs生物标志物用于检测痛风，其具体过程为：
[0021] 1?采用Microarray芯片筛选候选的痛风相关miRNAs:
[0022] 收集4例急性痛风性关节炎、4例单纯高尿酸血症及4例健康对照者的血清，使 用凝血管采集全血，采血后两小时内分离血清，采血后轻轻倒转采血管混合4-5次，直立置 于室温待血液完全凝固，l〇〇〇g离心10分钟，分离血清；将分离出的血清转移至单独的冻 存管，按照每500ul/管分装好；再利用exqion的LNA?microRNAMicroarray对痛风血清 的表达谱进行高通量的筛选；根据预设的条件，从中筛选出痛风miRNAs特异表达谱，然后 依次进行血清总RNA的抽提与纯化、miRNA荧光标记、miRNA芯片杂交后以AxonGenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，并以GenePixproV6.0读取芯片各探针的原始荧光强度，最后 进行数据分析，从而建立痛风患者血清miRNAs特异表达谱，筛选出痛风血清候选miRNAs; 筛选标准为：1)表达水平变化倍数（FoldChange) >2 (低表达时低于0. 5) ;2)P值〈0. 05 ; 3)检测率大于75% ;4)通过差异表达的火山图（VolcanoPlot);筛选出在痛风患者中 高表达或低表达的20个miRNAs,其中表达上调6个，包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、 hsa-miR-4531、hsa_miR-3611、hsa-miR-652_5p和hsa-miR-4654 ;表达下调的有 14个，包括 hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、hsa-miR-4763_5p、hsa-miR-374b_5p、hsa-miR-106b_5p、 hsa-miR-589-5p、hsa-miR-3907、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-361-5p和hsa-miR-30c_5p(见 表1，及图1和图2);上述20个miRNAs的序列见表2。
[0023] 表1 :痛风患者血清中高表达及低表达的miRNAs
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【主权项】
1. 一种痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于痛风血清miRNAs生物标志物 包括 hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa_miR-451a、hsa-miR-223_3p、 hsa-miR-589_5p 和 hsa-miR-885_5p〇
2. 根据权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于痛风血清miRNAs为 来自外周静脉血的血清。
3. 根据权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物，其特征在于所述痛风血清 miRNAs生物标志物能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片。
4. 一种如权利要求1所述痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测方法，其特征在 于包括以下步骤： (1) 逆转录：采用逆转录试剂盒和miRNAs特异性茎环结构逆转录引物进行miRNAs逆 转录反应，反应体系包括3uL 5*的逆转录引物、I. 5uL 10*的逆转录缓冲液、0. 20uL的RNA 抑制剂、〇. 15uL lOOmmol/L的dNTP和dTTP混合物、IuL逆转录酶，每个反应体系中加入 9. 15uLRNA，总反应体系为15uL ;该方法的反应条件为：16°C反应30分钟，42°C反应30分 钟，最后85 °C孵育5分钟； (2) 实时荧光定量PCR :反应体系包括：0. 25uL 20*miRNA检测探针、2. 5uL 2*Master 1^1、1.251^双蒸水、11^稀释后的〇0嫩，共5此，每个11^1?隱检测实施3平行；使用八81 ?1^81117900荧光定量？〇?仪检测，其反应条件 ：951：10分钟、951：15秒、601：1分钟，以 上阶段进行40个循环，完成对痛风血清miRNAs生物标志物的表达量的检测。
【专利摘要】本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种痛风血清miRNAs生物标志物及其表达量的检测方法,痛风血清miRNAs生物标志物包括hsa-miR-3146、hsa-miR-4449、hsa-miR-4531、hsa-miR-451a、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-5p和hsa-miR-885-5p，这些标志物作为血清重要的生物学检测指标，能用于制备痛风诊断试剂或生物芯片等工具，在痛风临床早期准确诊断有重要价值，为以后从分子水平诊断痛风及痛风血清miRNAs的研究提供了理论依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-113
【公开号】CN104651513
【申请号】CN201510080131
【发明人】王颜刚, 赵世华, 侯旭
【申请人】青岛大学附属医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月15日