一株哈茨木霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物保护领域，具体设及一株哈茨木霉在抗桑権菌核病病害中的应 用。
【背景技术】
[0002] 桑権菌核病是危害桑権的主要真菌病害。其发病种类主要有3种，分别是桑 権肥大性菌核病、桑権缩小性菌核病、桑権小粒性菌核病。其对应的病原菌分别为桑 实杯盘菌（Ciboria shiraiana)，肉阜状杯盘菌（Ciboriacarunculoides)，核地杖菌 (Sclerom;Uulashiraiana)。桑権菌核病传染性强，发病范围广，在全国各地区均有发生。 一般地势低珪，通气透光性差、湿度大的桑园发病较严重，发病率高达30%~90%，甚至绝 收，给果桑产业造成毁灭性危害。
[0003] 目前我国大多都是采用农艺防控、化学手段来防治桑権菌核病。农艺防控措施主 要有；摘除病枝病果，深翻±壤，覆盖地膜等，需要消耗大量人力、物力、财力。化学药剂防 治是主要措施，如；果农普遍使用的50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基托布津可湿性粉剂、 40%菌核净可湿性粉剂等，都对桑権菌核病的发生有一定预防作用。虽然该些药剂对人、畜 低毒性且高效、方便，但是长期使用仍易对环境产生危害，而且使用农药易留有残留，给人、 畜带来一定的安全隐患。同时，农药的长期使用容易使病原菌对农药产生抗性，产生对环 境、食品的累积性污染等问题，所W对生物源农药，特别是从天然植物、动物及微生物中寻 找和开发新型杀菌剂的开发研究是当前的研究热点。专利号200910103552. 4的发明专利 《一种抗肥大型菌核病菌的中药提取物》提供了一种用中草药提取物制成的抗桑権肥大型 菌核病的杀菌剂；刘华才等研究了一种综合性生物药肥对桑権菌核病的防控效果，发现该 生物药肥AS300倍液和500倍液可有效抑制桑権菌核病发生，可代替其他杀菌剂在果桑上 使用。该2种方法与W往的防治手段相比，安全系数相对增加。
[0004] 木霉是±壤中普遍存在，具有很大应用潜力的一类真菌，其生防效果已在很多应 用实验中得到证实。迄今为止，已有50多种木霉制剂注册上市，如美国的Topshield(哈茨 T-22)和W色列的Trichodex(哈茨木霉T-39)已经商品化生产。据不完全统计，木霉至少 对18个属29种病原真菌有括抗作用，其中一半是±传病原真菌。针对病原菌产生的一些 如菌核、厚垣抱子、卵饱子等特殊的组织结构，木霉能在其周围大量定殖，形成较大群体，并 随根的生长扩大其分布范围。木霉对主要±传病害病原真菌镶刀菌、疫霉、腐霉、立枯丝核 菌等都有很好的防治效果。
[0005] 本发明尝试在桑権菌核病病害发生前期对病原菌施用木霉菌剂，不仅具有对动 物、环境无污染的特点，同时使病害在发生前期即可得到控制，降低桑権菌核病的发病率。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题；本发明的目的是提供一株哈茨木霉（Trichoderm址arzianum) 及其应用，该木霉菌株具有防治桑権菌核病的功能。
[0007] 技术方案；哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6,该菌株已保藏在中国普通微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国 科学院微生物研究所，保藏日期；2014年10月16日，保藏号为；CGMCCNo. 9772。
[000引 所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6在抗桑権菌核病中应用。
[0009] 上述应用的具体方法为；在桑树萌芽期、始花期、盛花期前后3~4d，于桑树根围 ±壤及桑树枝条上及时喷洒木霉制剂，每个时期喷洒1~2次。
[0010] 上述应用中，哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6发酵产物，与水W 1:10体积 比混合，有效抱子浓度为1 X 106个抱子/mL。
[0011] 哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6在制备抗桑権菌核病药物中应用。
[0012] 抗桑権菌核病药物，有效成分含有哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6。本发 明的木霉Tr 16菌株具有W下生物学特性：
[0013] 菌落生长迅速，3~4d即可布满整个平板。气生菌丝先为白色，后产生绿色的分生 抱子，菌落背面无色。产抱区平展，呈同屯、轮纹状排列。在显微镜下观察，分生抱子梗透明， 壁光滑，瓶梗呈安肅瓶型，多数为3~7 X 1. 2~3 y m ;分生抱子梗初级分支几乎成直角，或 稍微朝顶方向弯曲；分生抱子为亚球形至球形，多数为2~2. 9 X 1. 9~2. 5 y m。
[0014] 本发明还提供了一种抗桑権菌核病的木霉菌剂，为哈茨木霉Trl6的发酵物，即 将Trl6接种于马铃馨葡萄糖液体培养基，28~30°C震荡培养5~6山并调节抱子浓度为 1 X 1〇6个/血，即得本发明的哈茨木霉菌剂。
[0015] 本发明还提供木霉Trl6菌剂的施用方法：将木霉菌剂与水W 1:10体积比混合，在 萌芽期、始花期、盛花期前后3~4山将木霉菌剂均匀喷洒于桑树根围±壤及桑树枝条上， W达到控制桑権菌核病的目的。
[0016] 有益效果；1、平板对時法表明Trl6具有较好的空间竞争能力，其代谢物质抑菌作 用较稳定，14化后抑菌率仍达82. 25%。
[0017] 2、将Trl6菌剂于桑権萌芽期、始花期、盛花期前后3~4d喷施，发现对桑権菌核 病具有较好的防治效果，防治效果达82. 53 %，且能减少农药及其废弃物造成的污染，有助 于保护农业生态环境。
【附图说明】
[0018] 图 1 为哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6 在 PDA 平板 28°C生长 6d 形态图；
[0019] 图2为哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6在显微镜下的瓶梗和抱子形态 图；
[0020] 图3为哈茨木霉（Trichoderm址arzianum)Trl6与病原菌的括抗效果图，其中A为 病原菌生长2d后在另一侧接种木霉，28°C生长4d后括抗情况巧为病原菌生长2d后在另 一侧接种木霉，28 °C生长8d后括抗情况。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可W对本发明作各种改动或修改，该些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0022] 实施例1 ;
[0023] 1.木霉的分离筛选与鉴定
[0024] 采用稀释涂布法对取自宜宾一发病桑园的±壤进行分离，筛选得到Trl6木霉菌 株。分离培养基为马铃馨葡萄糖琼脂培养基（PDA)和TSB培养基。
[002引所述的PDA培养基组成为冯铃馨200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馈水lOOOmL，自 然抑；
[0026] 所述的 TSB 培养基组成为；饥挪〇31径；皿2口〇4〇. 9g;M拆〇4.7&0 0. 2g;KCl 0. 15g; 玫瑰红0. 15g ;氯霉素0. 25g ;链霉素0. 05g ;PCNB 0. 15g ;甲霜灵0. 08g ;苯菌灵0. 0005g ; Triton X-100 lml;Water IL;调抑至 5-5. 5。121°C灭菌 20min。
[0027] 2.形态学鉴定
[0028] 将纯化培养的Trl6菌株接种到PDA平板中央，28°C培养3~5d，观察木霉的生长 情况。木霉菌落生长迅速，菌丝白色，呈卷毛状；3d后菌落半径达8cm ;3~4d即可产生绿 色的分生抱子，分生抱子丰富；菌落反面无色。
[0029] 挑取适量菌丝在显微镜下观察，菌丝透明，壁光滑。分生抱子梗透明，壁光滑；较 直，粗大且刚硬；初级分枝近直角，二次分枝复杂，2~4个呈縱祸状排列，整个结构类似金 字塔形状。瓶梗为安肅形，基部明显鎌缩，中部显著膨大，多数为3. 39~6. 55X 1. 26~ 2. 9 ym。分生抱子大多为亚球形，壁光滑，半透明至浅绿色，多数为2. 02~2. 89X 1. 99~ 2. 46 y m。
[0030] 3.分子生物学鉴定
[0031] 接种适量Tr 16木霉菌丝到液体PDA培养基中，28°C摇瓶培养5d后抽滤收集菌丝 体，然后提取其基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR反应所用通用引物分别为口S1和 ITS4。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带进行纯化回收测序。将测得的菌的 基因序列提交到GenBank数据库中，用Blast进行相关序列捜索，与GenBank数据库中现有 的近缘菌株的ITS序列进行比对，并从数据库中获得相关序列。
[0032] 实施例2 ;
[0033] 保藏号为；CGMCC No. 9772 的哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6 的括抗效果 研究。
[0034] 在无菌PDA培养基两侧分别接种已纯化培养的病原菌菌块和木霉菌块（d = 8mm)， 28°C培养4d、8d后观察化16对病原菌的括抗效果。木霉对桑権菌核病病原菌有抑制作用， 表现为生存空间的竞争。两者接触后，病原菌无法再向着木霉方向生长，而Trl6则能继续 接触、缠绕病原菌生长，逐渐覆盖于病原菌的菌落上。
[0035] 然后采用玻璃纸法研究Trl6木霉次生代谢物质对桑権菌核病病原菌的抑菌作 用；在无菌PDA平板上铺上无菌双层玻璃纸，在平板中央接种d = 8mm的木霉菌块，28°C培 养7化后移去玻璃纸。然后接种d = 8mm的病原菌菌块，28°C培养48~14化后采用十字 交叉法测定菌丝块直径，计算抑菌率。接种4她后，抑菌率为91. 01%，9化后为91. 32%， 14化后为82. 25%。W只接种病原菌菌块的PDA平板为对照。每个处理3个重复。
[0036] 抑菌率（％ ) = ((对照生长直径-处理组生长直径）/对照生长直径）X 100
[0037] 表1木霉非挥发性物质对Sclerotiniasclerotiorum的抑菌率
[00%]
【主权项】
1. 哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6,该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年10月16日，保藏号为：CGMCC No. 9772。
2. 权利要求1所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum)T;rl6在抗桑椹菌核病中应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于在桑树萌芽期、始花期、盛花期前后3~ 4d，于桑树根围土壤及桑树枝条上及时喷洒木霉制剂，每个时期喷洒1~2次。
4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于哈茨木霉（Trichodermaharzianum)Trl6发 酵产物，与水以1:10体积比混合，有效孢子浓度为1 X 106个孢子/mL。
5. 权利要求1所述哈茨木霉（Trichodermaharzianum)T;rl6在制备抗桑椹菌核病药物 中应用。
6. 抗桑椹菌核病药物，其特征在于有效成分含有哈茨木霉（Trichodermaharzianum) Trl6〇
【专利摘要】一株哈茨木霉(Trichodermaharzianum)及其应用，该菌株已保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年10月16日，保藏号为：CGMCC No.9772。平板对峙法表明Tr16具有较好的空间竞争能力，其代谢物质抑菌作用较稳定，144h后抑菌率仍达82.25％。将Tr16菌剂于桑椹萌芽期、始花期、盛花期前后3～4d喷施，发现对桑椹菌核病具有较好的防治效果，防治效果达82.53％，且能减少农药及其废弃物造成的污染，有助于保护农业生态环境。CGMCC No.977220141016
【IPC分类】C12N1-14, A01N63-04, A01P3-00, C12R1-885
【公开号】CN104673686
【申请号】CN201510130322
【发明人】张健, 马佳慧, 韩蓓蓓, 吴福安, 王俊
【申请人】江苏科技大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月24日