一种重组载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (CTLA4)是T淋巴细胞表面的受体，是抑制T细 胞活化的共刺激分子，当T细胞表面受体CTLA4与APC上的B7分子结合后，会抑制T细胞 的活化，从而抑制T细胞的过度活化。很多过度免疫反应引发的疾病均与CTLA4蛋白的低 表达有着极为密切的关系，如同种异体移植引发的免疫排斥反应、慢性支气管哮喘、风湿性 关节炎（RA)、艾滋病、系统性红斑狼疮、银屑病、内毒素性休克病等疾病，因此CTLA4蛋白或 融合蛋白在这些疾病的特异性治疗方面有着十分广阔的应用前景。此外，CTLA4蛋白在机 体内的过度表达与很多疾病特别是肿瘤有着密切的关系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和 食道癌、利什曼病等。CTLA4的单克隆抗体CTLA4mAb可广泛用于抗肿瘤的免疫治疗，是目前 肿瘤基因治疗的研究热点及方向。获得具有生物学功能、接近人类天然CTLA4蛋白的重组 蛋白是CTLA4特异性治疗疾病的关键。
[0003] 因此，有必要提供一种在真核细胞中表达CTLA4重组蛋白的表达载体。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种重组载体，所述重组载体为酵母分 泌表达载体pPICZaA的重组载体，该重组载体含有人源CTLA4胞外区基因，可用于表达人源 CTLA4融合蛋白。该重组载体还含有Kex2蛋白酶酶切位点、His标签和c-myc标签，可使得 表达的CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式释放到胞外，并对蛋白进行纯化，为CTLA4蛋白的 工业化生产提供了一种简便的方法。本发明第二方面提供了一种重组菌，该重组菌包含第 一方面所述的重组载体。本发明第三方面提供了一种重组载体的制备方法。本发明第四方 面提供了一种基因，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示的DNA分子。本发明第五 方面提供了一种重组载体的应用。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种重组载体，包含如SEQ ID N0 :1所示的基因，所述重 组载体为重组pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。
[0006] 本发明采用的pPICZaA质粒含有His标签(组氨酸标签）和c-myc标签，能使表达 后的蛋白带上这两种标签，His标签有利于表达后融合蛋白的分离纯化，c-myc标签有利于 融合蛋白在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。
[0007] 优选地，如第一方面所述的基因插入pPICZaA质粒的Xho I和Xba I位点。
[0008] 第二方面，本发明提供了一种重组菌，包含如第一方面所述的重组载体，所述重组 菌为重组毕赤酵母GS115菌株。
[0009] 本发明提供的如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列包括Kex2蛋白酶酶切位点的编 码序列和CTLA4胞外区的编码序列（Gene Bank克隆号：NM-005214. 3)。
[0010] Kex2蛋白酶位于酵母细胞膜中，是a-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶 切位点Lys-Arg，通过对酶切位点之前的信号肽的切割而得到天然N端的CTLA4蛋白（由于 本发明提供的Kex2酶切位点的上游是质粒的Xho I位点，下游紧邻CTLA4蛋白胞外区序 列，因此，切割后能得到天然的N端CTLA4蛋白胞外区；该天然N端是指在CTLA4蛋白胞外 区的N端不含有其它任何多余系列）。
[0011]本发明提供的如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列在酵母中表达后，能得到含有Kex2蛋白酶酶切位点的CTLA4胞外区融合蛋白，该Kex2蛋白酶酶切位点经酵母细胞膜的 Kex2蛋白酶切割，促使CTLA4胞外区融合蛋白分泌到胞外。
[0012] 第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的重组载体的制备方法，包括如下 步骤：
[0013] (1)、设计CTLA4基因胞外区片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引 物的碱基序列分别如SEQIDN0:2和SEQIDN0:3所示；
[0014] (2)、提供或制备CTLA4基因模板，并以步骤（1)所得上游引物和下游引物为PCR引 物，扩增CTLA4基因胞外区片段；
[0015](3)、取pPICZaA质粒，将步骤（2)扩增得到的CTLA4基因胞外区片段和所述 pPICZaA质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组 载体。
[0016] 优选地，所述步骤（2)中，所述CTLA4基因模板为含有CTLA4基因的重组载体 PGEM-T-CTLA4。
[0017] 本发明采用的pGEM-T-CTLA4质粒含有人CTLA4基因全长ORF (Gene Bank克隆号 为 NM-005214. 3)
[0018] 优选地，所述步骤（3)中，所述双酶切反应所采用的内切酶为XhoI内切酶和Xba I内切酶。
[0019] 所述如SEQIDN0:2所示的上游引物具体为：
[0020] 5, -CCGCTCGAGAAAAGAAAAGCAATGCACGTGGCC-3'
[0021] 所述如SEQIDN0:3所示的下游引物具体为：
[0022] 5, -GCTCTAGAGCGTCAGAATCTGGGCACGGTT-3'
[0023] 该上游引物（CTLA4up)和下游引物（CTLA4down)的组成如下：
[0024；
【主权项】
1. 一种重组载体，其特征在于，包含如SEQ ID NO :1所示的基因，所述重组载体为重组 pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。
2. -种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述重组载体。
3. 根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为重组毕赤酵母GS115菌 株。
4. 一种如权利要求1所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 、设计CTLA4基因胞外区片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的 碱基序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示； (2)、提供或制备CTLA4基因模板，并以步骤（1)所得上游引物和下游引物为PCR引物， 扩增CTLA4基因胞外区片段； (3)、取pPICZaA质粒，将步骤（2)扩增得到的CTLA4基因胞外区片段和所述pPICZaA质 粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组载体。
5. 如权利要求4所述的一种重组载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中，所述 CTLA4基因模板为含有CTLA4基因的重组载体pGEM-T-CTLA4。
6. 如权利要求4所述的一种重组载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)中，所述 双酶切反应所采用的内切酶为Xho I内切酶和Xba I内切酶。
7. -种基因，其特征在于，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示的DNA分子。
8. 如权利要求1所述的重组载体在制备免疫或肿瘤疾病药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种重组载体及其制备方法和应用。本发明提供的重组载体采用酵母分泌表达载体pPICZaA构建，含有人源CTLA4胞外区基因，可用于表达人源CTLA4融合蛋白；该重组载体还含有Kex2蛋白酶酶切位点、His标签和c-myc标签，可使得表达的CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式释放到胞外，并对蛋白进行纯化，为CTLA4蛋白的工业化生产提供了一种简便的方法。
【IPC分类】C12N15-66, C12N15-12, C12N1-19, A61P35-00, A61P37-00, C12N15-81, A61K38-17, C12R1-84
【公开号】CN104673822
【申请号】CN201310612966
【发明人】万晓春, 陈凤莲, 王蒲, 赵琦, 阮庆国
【申请人】深圳先进技术研究院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年11月27日