新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及检测试剂盒，尤其是一种 新型布尼亚病毒的核酸环介导逆转录等温扩增检测方法及检测试剂盒，可应用于新型布尼 亚病毒的实验室快速检测。
【背景技术】
[0002] 由新型布尼亚病毒感染人体引起的发热伴血小板减少综合征，是一种以发热伴白 细胞、血小板减少和多脏器功能损伤为主要临床表现的新发传染病。新型布尼亚病毒感染 后可迅速引起患者肝、肾功能受损，使患者因弥漫性血管内凝血、休克、呼吸衰竭而死亡，死 亡率高达30%。流行病学研究显示新型布尼亚病毒分布极为广泛：自2010年我国首次对 新型布尼亚病毒进行成功分离鉴定以来，目前已在山东、湖北、浙江、江苏等多个省市发现 新型布尼亚病毒感染病例。2011-2013年，美国密苏里州、日本、韩国也相继报道发现有经蜱 虫叮咬传播的类似新型布尼亚病毒感染病例。蜱传新型布尼亚病毒感染已逐渐成为全球性 的重要公共卫生问题。
[0003] 被新型布尼亚病毒感染者往往急性起病且死亡率高，但目前对新型布尼亚病毒感 染的治疗还是以对症支持治疗为主。临床治疗主要通过使用广谱强效抗病毒药物，同时依 靠患者自身免疫状态的提升，以达到抵抗新型布尼亚病毒感染的效果。值得关注的是，新型 布尼亚病毒感染的及时检测诊断，对于疾病的治疗具有重要意义，可以显著提高治疗效果。 新型布尼亚病毒感染往往发生在山区丘陵地区，通过新型布尼亚病毒快速检测技术来加强 对野外生存环境中该病毒的检测，可以为新型布尼亚病毒感染的防制提供重要依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新型布尼亚病毒的环介导逆转录等温扩增检测方法及 检测试剂盒，该方法及检测试剂盒应具有特异性好、检测灵敏度高、稳定、准确、检测效率 高、操作快速简便等特点。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] -种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒 中的RT-LAMP反应液包括以下组分：
[0007] 特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、 吐温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBRGreenI蜡微晶颗粒、无RNA酶的水；
[0008] 所述特异性扩增引物序列如下：
[0009] F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3，
[0010] B3 :5, -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3'
[0011] FIP: 5 ' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3 '
[0012] BIP:5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3'。
[0013] 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒中各组分的相应含量如下：
[0014] 缓冲液 1.5-2.5mol/L 脱氧核糖核苷三磷酸 0.1-0.2 mol/L 甜菜碱 0.06-0.丨Omol/'L 氯化钾 0.8-1.2mol/L 硫酸铵 0.8-1.2mol/L 硫酸镁 0.06-0.10 mol/mL 引物FIP、BIP (两者比例相同） 0.1-0.2mmol/L 引物F3、B3 (两者比例相同） 0.01-0.03 mmol/L 染料 50-150 ^iL
[0015] 吐温-20 50-150 ul DNA聚合酶 800-1200 U 逆转录酶 40-60 U 无RNA酶的水（RNase free dH20) 500-1500 瓜。
[0016] 所述染料为SYBR Green I蜡微晶颗粒。
[0017] 所述缓冲液为Tris-HCl。
[0018] 一种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤 进行：
[0019] (1)提取待测样品RNA ;
[0020] (2)以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成一步法环介导逆转录等温扩 增检测体系：特异性引物、缓冲液、甜菜碱、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、脱氧核糖核 苷三磷酸、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒；
[0021] 所述特异性引物序列如下：
[0022] F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3，
[0023] B3 :5, -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3'
[0024] FIP :5, -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3'
[0025] BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3' ；
[0026] (3)新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果的阴阳性可以用肉眼判断； 如果反应后混合物由橘黄色变为绿色，则判断为阳性，即待测样品含有新型布尼亚病毒核 酸；如果反应后混合物保持橘黄色不变，则判断为阴性。
[0027] 所述步骤（2)中环介导逆转录等温扩增检测体系中各成分的终浓度如下：
[0028]
[0029]
【主权项】
1. 一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中 的RT-LAMP反应液包括以下组分： 特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐 温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒、无 RNA酶的水； 所述特异性扩增引物序列如下： F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3， B3 :5' -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3' FIP :5' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3' BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3'。
2. 根据权利要求1所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在 于新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒中各组分的相应含量如下：
3. 根据权利要求1或2所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特 征在于所述染料为SYBR Green I蜡微晶颗粒。
4. 根据权利要求3所述新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，其特征在 于所述缓冲液为Tris-HCl。
5. -种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤进 行： (1) 提取待测样品RNA ; (2) 以待测样品RNA为模板，与下列物质混合配制成一步法环介导逆转录等温扩增检 测体系：特异性引物、缓冲液、甜菜碱、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、脱氧核糖核苷三 磷酸、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒； 所述特异性引物序列如下： F3 :5, -GGCCGAGAGACACTGACAT-3， B3 :5' -CCTCGAGACAGTCCCTGAAG-3' FIP :5' -TGCAGGATGGCTCCTTCTTCCCCGCAGCATACCTCTGGA-3' BIP :5' -ACAATTGGGCCTGGTCACATGCCTATTGTCGATGCCTTGGGT-3' ； (3)新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测结果的阴阳性可以用肉眼判断；如果 反应后混合物由橘黄色变为绿色，则判断为阳性，即待测样品含有新型布尼亚病毒核酸；如 果反应后混合物保持橘黄色不变，则判断为阴性。
6. 根据权利要求5所述新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方 法，其特征在于所述步骤（2)中环介导逆转录等温扩增检测体系中各成分的终浓度如下：
其余是作为溶剂的无 RNA酶的水； 新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测体系总体积为25 μ L。
7. 根据权利要求6所述新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测 方法，其特征在于所述步骤（2)中环介导逆转录等温扩增检测条件如下：65°C 60min， 95°C 2min。
【专利摘要】本发明涉及新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测方法及试剂盒。目的是提供的方法及检测试剂盒应具有特异性好、检测灵敏度高、稳定、准确、检测效率高、操作快速简便等特点。技术方案是：一种新型布尼亚病毒环介导逆转录等温扩增检测试剂盒，试剂盒中的RT-LAMP反应液包括以下组分：特异性扩增引物、脱氧核糖核苷三磷酸、甜菜碱、缓冲液、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、吐温-20、DNA聚合酶、逆转录酶、SYBR Green I蜡微晶颗粒、无RNA酶的水。一种新型布尼亚病毒非诊断目的的环介导逆转录等温扩增检测方法，按以下步骤进行：(1)提取待测样品RNA；(2)配制成一步法环介导逆转录等温扩增检测体系(3)判断结果。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公开号】CN104673933
【申请号】CN201510018039
【发明人】张严峻, 张磊, 蒋健敏, 沈广强
【申请人】浙江省疾病预防控制中心
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年1月14日