基于分子胶的荧光标记核苷酸及其在dna测序中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一类基于分子胶的荧光标记核苷 酸及其在DNA测序中的用途。
【背景技术】
[0002] DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的 Sanger测序技术（一代测序）开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提 高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算 的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测 序技术，人类基因组计划（HGP)耗资30亿美元完成人整个基因组（30亿个碱基）的序列测 定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。
[0003] 虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床 医学对测序的要求。单分子测序技术（三代测序技术）应运而生。三代测序技术的核心是 直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分 子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。
[0004] 目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是， 国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我 们能有所突破，在测序试剂等配套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代 测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平 台具有战略性的意义。近年来，我们发现基于氢键序列特异性作用下形成二硫键化合物时， 其交叉偶联反应产物的选择性很高，而自身偶联产物得到了有效抑制。该方法用于合成含 二硫键两亲性嵌段共聚物及其自组装胶束已取得较好效果。但是将该方法用于连接小分子 化合物时，却遇到了一系列困难，首先反应的选择性很差，通过对反应条件的反复筛选和优 化，最终得到了在特定的条件下连接特定小分子化合物时，仍然能得到良好选择性的交叉 欧联产物。在这种情况下，才有可能将其应用于DNA测序以及其它领域。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一类基于分子胶的荧光标记核苷酸及其在DNA测序中的 用途；该基于分子胶的荧光标记核苷酸作为可逆终端具有氧化还原敏感特性。本发明在前 期工作基础上，通过多学科交叉，首先合成了新型荧光标记核苷酸，并发展基于该新型核苷 酸的DNA延伸反应，实现可用于DNA测序的试剂。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007] 第一方面，本发明涉及一种基于分子胶的荧光标记核苷酸，其结构式如式（I )所 示：
[0008]
【主权项】
1. 一种基于分子胶的荧光标记核苷酸，其特征在于，其结构式如式（I)所示：
dNTP为核苷三磷酸，N为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶； 突光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、咕吨、花青、花、酞菁、alexa、squarene染料、产生 能量转移染料的组合以及其衍生物。
2. 根据权利要求1所述的基于分子胶的荧光标记核苷酸，其特征在于，所述基于分子 胶的突光标记核苷酸选自
3. -种根据权利要求2所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合成方法，其特征在 于， 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸的结构式如式（II)所示时，其合成为：
应，即得； 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸的结构式如式（III)所示时，其合成为：化合物dUTP-A-click
化合物TAMRA-B，在氧化条件下，发生脱三苯基甲基共聚反应生成双重二硫键，即得； 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸的结构式如式（IV)所示时，其合成为：化合物 TAMRA-B-clid
与化合物dUTP(AP3) -A，在氧 化条件下，发生氧化反应生成双重二硫键，即得； 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸的结构式如式（V)所示时，其合成为：化合物TAMRA-B-click与化合物dUTP-A-click，氧化条件下，发生脱三苯基甲基共聚反应，生成双 重二硫键，即得。
4.根据权利要求3所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合成方法，其特征在于， 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸结构式（II)的合成中，化合物TAMRA-B与化合物 dUTP(AP3)-A的摩尔比为3:1~3 ; 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸结构式（III)的合成中：化合物TAMRA-B与化合物dUTP-A-click的摩尔比为3:1~3 ; 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸结构式（IV)的合成中：化合物TAMRA-B-click与 化合物dUTP(AP3) -A的摩尔比为3:1~3 ; 所述基于分子胶的荧光标记核苷酸结构式（V)的合成中：所述化合物TAMRA-B-click和化合物dUTP-A-click的摩尔比为 1:0. 5 ~2。
5. 根据权利要求3所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合成方法，其特征在 于，所述dUTP(AP3)-A的合成为：化合物
化合物 dUTP(AP3：生缩合剂作用下发生酰胺化反应，即 得。
6. 根据权利要求3所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合成方法，其特征在 于，所述化合物TAMRA-B的合成为：化合物1
与荧光素 m
在缩合剂作用下，发生酰胺化反应，即得。
7. 根据权利要求3所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合 成方法，其特征在于，所述化合物dUTP-A-click的合成为：将化合物
与2-叠氮乙? ^进行缩合反应，得化合 h3 物A-
将化合物dU-
与1，6-庚二炔在催化剂作用下，进行交叉偶联 反应反应，得化合物dU-I然后化合物dU-P与三正丁胺 …
9 焦磷酸盐和2-氯-4H-1，3, 2-苯并二氧磷-4-酮共同作用下发生反应，得化合物dUTP-P
将化合物dUTP-P的炔基与化合物A-N3发生点击化学反应，即得化合物dUTP-A-click。
8. 根据权利要求3所述的基于分子胶的突光标记核苷酸的合成方法，其特征在于，所 述化合物TAMRA-B-click的合成为：将化合物B
? 2-叠氮 溴乙；
g生取代反应，得化合物B-R
荧光素TAMR
与丙炔氨
<nh2发生酰胺化反应，得化合物 TAMR/
化合物TAMRA-P与化合物B-N3发生click反应，即得化合物TAMRA-B-click。
9. 一种根据权利要求1或2所述的基于分子胶的荧光标记核苷酸在DNA测序中的用 途。
【专利摘要】本发明公开了一种基于分子胶的荧光标记核苷酸及其在DNA测序中的用途；所述荧光标记核苷酸的结构式如式(Ⅰ)所示：，其中，R1为或R2为荧光素或dNTP为含四个不同的碱基的核苷三磷酸；荧光素选自BODIPY、罗丹明、香豆素、呫吨、花青、芘、酞菁、alexa、squarene染料、产生能量转移染料的组合以及其衍生物中的一种。本发明的荧光标记核苷酸可用于DNA测序；同时，本发明荧光标记核苷酸的合成所需原料简单易得，可用于大规模推广使用，并且生物学评价结果表明该类可逆终端能完全满足高通量测序的生化反应所有要求，具备很好的实用前景。
【IPC分类】C12Q1-68, C07H1-00, C07H19-10, C09K11-06
【公开号】CN104693258
【申请号】CN201410692943
【发明人】沈玉梅, 龚兵, 谭连江, 邵志峰, 杨晴来, 李小卫, 姜玉, 张震
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年11月26日