厌氧微生物的发酵方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微生物的发酵方法，尤其涉及借助能产生丁醇、丙酮、乙醇和/或异丙醇的微生物进行厌氧微生物发酵的方法，属于微生物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002]众所周知，厌氧微生物的培养有两个传统培养步骤，即通过物料通过量或限制磷酸盐控制发酵过程，使在第一步(培养)保持恒定的高浓度微生物，即产生稳定的平衡状态，并使一部分底物转化为丁醇、丙酮和/或乙醇。在第二步则以尽可能短的时间使所需产物达到最高产量。如果第一步中物料通过量过高，则会造成冲掉的细胞多于新生长的细胞。相反，需要时可以低物料通过量来控制细胞生长。
该方法的缺点一则产量仍然不能令人满意，二则不能保持连续培养的长期稳定性，即不能保持几百小时或更长时间的稳定产量。其原因在于所形成的产物即丁醇、丙酮和/或乙醇或异丙醇对发酵微生物具有毒害作用，因此，在生成产物达到一定浓度时，会终止产物的形成或严重损害微生物培养发酵。该已知方法还值得注意的另一个缺点在于几乎只有用己糖才能得到令人满意的结果。
因此，急需业界人员进行进一步的探索与研发。
【发明内容】
[0003]针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是，提供一种厌氧微生物的发酵方法，其可以很长时间内能稳定地提高产量，且安全无污染，效率高。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为:
一种厌氧微生物的发酵方法，该方法至少分两步进行，第一步主要是连续培养微生物，第二步主要是通过连续或分批加料生成产物，在第二步将微生物固定在载体材料上；
所述载体材料采用开孔烧结玻璃、浮石或含有大量S12并具有开孔结构的等同物，孔径为30-180 um，吸水性至少为0.35ml/cm3，载体材料与总操作体积的比为1: 8至1: 1.5。
[0005]优选的，从产物形成阶段除去培养基，然后通过提取，优先采用已知方法，用高级醇或高级脂肪酸分离生成的产物，再将形成少量产物反应相返回到产物形成阶段和/或本方法的第一步处理。
优选的，在进行第一步处理时，采用连续蒸发方法，从培养基中蒸除产物。
优选的，采用蒸发膜，尤其是硅橡胶膜，蒸除产物，蒸除的温度为40-80°C，并且采用载体气体，如N2、H2、C02、C0或这些气体的混合物，或采用发酵气体或采用真空方法降低蒸发时的蒸发压。
优选的，在第二阶段采用气体汽提方法对产物进行最佳的连续分离。
进一步的，采用汽提气，如N2、H2、C02、C0或这些气体的混合物，或发酵气体对产物进行连续分离，液体与气体的体积流动比为0.06: I至1.8: 1，温度为40-80°C。 优选的，按第二步处理的产物含量控制营养液和/或糖溶液的加入量。
在第一步中应予注意的是，选择的高物料通过量的多少应能使微生物生长，并且在产酸阶段中没有明显地形成产物。在此生长阶段，微生物发展其良好的粘附特征，然后带着这种特征进入第二步，使微生物固定在载体材料上。如果在第一步中选择的物料通过量过低，则细胞生长终止，同时可能形成产物，由此还会失去微生物对载体材料良好的吸附特征。
[0006]采用微量过滤法，尤以错流微量过滤法为佳，在第二步中将细胞与培养基分离，可以代替微生物固定地方法，然后再返回，这样也可获得与固定法同样的效果。
[0007]另外，在第一步中高浓度产物(由于低物料通过量造成)会导致微生物的退化，从而使生成的产物生成新的酸，从经验得知，这种变化是不可逆的。而在第一步物料通过量过高，则会将微生物冲走，从而在一定时间后，导致用于第二步的细胞数量不足。
[0008]因此，物料通过量必须按具体情况确定。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是:
本发明的发酵方法可以很长时间内能稳定地提高产量，且安全无污染，效率高，应用前景好。
【具体实施方式】
[0009]以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
[0010]实施例1
由下列组合物配制的培养基用作营养培养基:
木糖(无水) 60g/l KH2P041g/l K2HP041g/l (NH4) 2S042g/l MgS04.7H20 0.lg/1 NaCl 0.01g/l Na2Mo04.2H20 0.01g/l CaC120.01g/l MnS04.H20 0.015g/l FeS04.7H20 0.015g/l 维生素H 0.lmg/1 氯化硫胺 0.002g/l 对氨基苯甲酸 0.002g/l Na2S2040.035g/l 刀天青 0.001g/l 酵母膏 0.5g/l Na400CCH32.2g/l
醋酪酸梭状芽胞杆菌ATCC824用作发酵菌，先将其进行适当培养后再用于本发明方法。 将供料罐中的营养基引入搅拌釜生物反应器，物料通过量为0.3/小时。接种量约为搅拌釜生物反应器容量的10%，在该反应器中保持在37°C温度和pH5.1下进行发酵。生物反应器中的细胞密度通过选择物料通过量大致保持不变，借以使由微生物培养中产生的新细胞通过管道进入固定床反应器，由于细胞粘附在载体材料上，所以它们在反应器中仍保持粘附状态。采用开孔烧结玻璃作为载体材料，烧结玻璃的体积相当于总体积的50%。固定床反应器内的温度保持在43°C，并且pH4.3进行发酵。在两步处理中总物料通过量为0.15/小时。固定床反应器内的反应物用氮气充气，由于固定床反应器内装有套管，所以可以保持循环。
产率和产量在表I中给出。
表I
稀释率(小时-1) 0.15 流出木糖(g/1) 28.59 糖利用量(％) 50.98 糖利用率(g/1.hr) 4.46 丁醇(g/1) 5.7 总溶剂量(g/1) 9.30 溶剂产量(％) 31.28 溶剂产率(g/1.hr) 1.395 总酸量(g/1) 3.06 酸产量(％) 5.88 光密度 2.765 pH 4.32 电负度(mv) -436 实施例2
在搅拌釜生物反应器和固定床反应器中选用相同的营养组合物、接种和方法条件。将一个可从中连续或分批取得生成产物的外循环分离系统与固定床反应器相连接。另外，将由固定床反应器得到的富含产物的培养基加热到40°C左右后引入到汽提塔，以与液体逆流方向将氮气引入塔内作为汽提气。液体与气体的体积流动比为0.35: I。基本上已汽提过产物的培养基，其中一部分在冷却到发酵温度后又进入到固定床反应器，小部分也可返回到搅拌釜生物反应器。
[0011]基本上汽提过产物的剩余液体从系统中排除。从汽提塔中排出的富含产物的气体流经冷却系统，将产物凝聚后排出。得到的稳态值在表2中给出。
[0012]表2
稀释率(小时-1) 0.15 流出木糖(g/1) 21.50 糖利用量(％) 62.50 糖利用率(g/1.hr) 5.37 丁醇(g/1) 6.82 总溶剂量(g/1) 10.87 溶剂产量(％) 30.36 溶剂产率(g/1.hr) 1.638
由表可见，采用实施例2的方法，即从外循环分离系统连续得到的产物，其溶剂产率和糖利用量显然较好。如上述实验所示，如果发酵很长时间如500小时，也会得到同样效果。
[0013]综上所述，本发明的发酵方法可以很长时间内能稳定地提高产量，且安全无污染，效率尚，应用前景好。
[0014]上述【具体实施方式】，仅为说明本发明的技术构思，目的在于让熟悉此项技术的相关人士能够据以实施，但以上所述内容并不限制本发明的保护范围，凡是依据本发明的精神实质所作的任何等效变化或修饰，均应落入本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种厌氧微生物的发酵方法，该方法至少分两步进行，第一步主要是连续培养微生物，第二步主要是通过连续或分批加料生成产物，其特征在于，在第二步将微生物固定在载体材料上； 所述载体材料采用开孔烧结玻璃、浮石或含有大量S12并具有开孔结构的等同物，孔径为30-180 um，吸水性至少为0.35ml/cm3，载体材料与总操作体积的比为1: 8至1: 1.5。
2.根据权利要求1所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，从产物形成阶段除去培养基，然后通过提取，优先采用已知方法，用高级醇或高级脂肪酸分离生成的产物，再将形成少量产物反应相返回到产物形成阶段和/或本方法的第一步处理。
3.根据权利要求2所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，在进行第一步处理时，采用连续蒸发方法，从培养基中蒸除产物。
4.根据权利要求3所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，采用蒸发膜，尤其是硅橡胶膜，蒸除产物，蒸除的温度为40-80 °C，并且采用载体气体，如N2、H2、CO2、CO或这些气体的混合物，或采用发酵气体或采用真空方法降低蒸发时的蒸发压。
5.根据权利要求1所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，在第二阶段采用气体汽提方法对产物进行最佳的连续分离。
6.根据权利要求4所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，采用汽提气，如N2、H2,CO2, CO或这些气体的混合物，或发酵气体对产物进行连续分离，液体与气体的体积流动比为 0.06: I 至 1.8: 1，温度为 40-80°C。
7.根据权利要求1所述的厌氧微生物的发酵方法，其特征在于，按第二步处理的产物含量控制营养液和/或糖溶液的加入量。
【专利摘要】本发明公开了一种厌氧微生物的发酵方法，该方法至少分两步进行，第一步主要是连续培养微生物，第二步主要是通过连续或分批加料生成产物，在第二步将微生物固定在载体材料上；所述载体材料采用开孔烧结玻璃、浮石或含有大量SiO2并具有开孔结构的等同物，孔径为30-180um，吸水性至少为0.35ml/cm3，载体材料与总操作体积的比为1∶8至1∶1.5。本发明的发酵方法可以很长时间内能稳定地提高产量，且安全无污染，效率高，应用前景好。
【IPC分类】C12P7-28, C12P7-16, C12P7-06
【公开号】CN104694582
【申请号】CN201510090875
【发明人】何志刚
【申请人】江苏高科物流科技股份有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月28日