一种糖核苷酸的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖核苷酸的制备方法，属于生物药物技术领域。
【背景技术】
[0002]糖类是生物体内最基本的组成部分之一，糖结构的表达异常是肿瘤表型的标志之一。结构均一性糖链的获得是破解它们生物功能谜题的先决条件。人们开发了多种合成复杂糖结构的方法和工艺。这个前沿领域的发展等为糖链功能的测定，糖链结构-功能关系的解析，生物合成途径的阐明，以及基于糖的抗菌抗癌疫苗的生产奠定基础。体外糖合成有两种常用策略:化学合成和酶法(包括化学-酶法)合成。复杂糖链目前依然是有机化学合成中具有挑战性的化合物。
[0003]实践检验，酶法合成被证明是化学合成的有效替代途径。与化学方法相此，酶法合成在更为有效进行高度空间和立体化学特异性的糖基化反应方面具有明显的优势。用于糖合成的酶主要是糖基转移酶。而糖基转移酶催化的反应需要糖核苷酸作为糖基供体。
[0004]然而，目前并没有一种高效率制备糖核苷酸的方法，仍需人们进一步探索。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种糖核苷酸的制备方法，其操作简单方便，效率高，适用于大规模生产。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案为:
一种糖核苷酸的制备方法，该方法包括如下步骤:
选择微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，其中所述微生物属于酵母属或克鲁维酵母属且具有从核鲁酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前体选自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷；
在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，其浓度为0.2-0.4Mm,反应PH值为6.5-7.5，使用氢氧化钠溶液调节pH，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸；并
从该水性介质中提取糖核苷酸。
[0007]优选的，培养液的处理物为培养液的浓缩物、培养液的千燥物、离心分离培养液得到的细胞、该细胞的干燥物、该细胞的冻干物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固定化产物或由该细胞中提取的酶制品。
[0008]优选的，所述糖核苷酸为尿苷二磷酸葡萄糖、尿苦二鱗酸半乳糖、尿香二鱗酸-N-乙醜葡糖胺或尿普二鱗酸-N-乙酰半乳糖胺。
[0009]优选的，所述糖选自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
[0010]优选的，所述微生物是酿酒酵母或马克斯克鲁维酵母。
[0011]本发明中微生物的培养可按通常的方法进行培养。
[0012]作为培养该微生物的培养基，只要含有该微生物可同化的破源、氮源、无机盐类等物质，并能有效地培养该微生物，不管是天然培养基还是合成培养基均可使用。
[0013]作为碳源，只要可为各种微生物同化就可以，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、枸橼酸、延胡索酸等各种有机酸；谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等各种氨基酸；乙醇、丙醇、甘油等醇类。
[0014]通过该培养得到的微生物的培养液以及将该培养液经种种处理的培养液的处理物为酶源，可以应用在水性介质中进行糖核苷酸的生成。
[0015]糖核苷酸的生成中使用的酶源的量为按湿菌体100 - 800g/l,优选50_600g/l。
[0016]本发明的优点在于:
本发明不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高价的原料，而可利用乳清酸等廉价的核苷酸前体物质及糖为原料，不必添加高价的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶，无需酶的分离操作，制作简单，效率高。
【具体实施方式】
[0017]下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0018]实施例1 UDP-Glc的生产
装有 2.5L 由葡萄糖 100g/l、MgSO4-7H20 lg/1、K2HPO4 35g/L 乳清酸(钾盐)3g/l 组成的反应液，容积为5L的培养槽中加市售的面包酵母的干燥处理物悬浮成100g/l (干燥重量换算)，在28°C下，以600rpni搅拌、通气量为2L/min的条件进行6小时的反应。
[0019]该反应中，用4N KOH维持反应液的pH值在6.5-7.5。
[0020]反应结束后，对反应液上清中的UDP-Glc进行定量，结果生成UDP-Glc 7.4g/l。
[0021]利用经离心分离该反应液去除菌体后得到的上清2L，精制UDP-Glc，得到含有高纯度m)P-Gic的溶出液。
[0022]浓缩该溶出液后添加过量的99%乙醇，生成的沉淀物经真空干燥后得到6.8g白色粉末。该白色粉末为高纯度(纯度97%以上)的UDP-Glc。
[0023]实施例2 UDP-GlcNAc 的生产
除了用100g/l麦芽糖代替葡萄糖，在反应液中新添加葡糖胺盐酸盐3.5g/l以外，在与实施例1同样的条件下生产UDP- GlcNAc0
[0024]反应结束后按上述的HPLC法对反应液上清中的UDP-GlcNAc进行定量，结果生成UDP-GlcNAc 7g/l (2Na盐换算)利用经离心分离该反应液去除菌体后得到的上清2L，按与实施例I同样的方法进行精制，得到高纯度(97%以上)的UDP-GlcNAc白色粉末。
[0025]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种糖核苷酸的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 选择微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，其中所述微生物属于酵母属或克鲁维酵母属且具有从核鲁酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前体选自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷； 在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，其浓度为0.2-0.4Mm,反应PH值为6.5-7.5，使用氢氧化钠溶液调节pH，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸；并 从该水性介质中提取糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种糖核苷酸的制备方法，其特征在于，培养液的处理物为培养液的浓缩物、培养液的千燥物、离心分离培养液得到的细胞、该细胞的干燥物、该细胞的冻干物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固定化产物或由该细胞中提取的酶制品。
3.根据权利要求1所述的一种糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述糖核苷酸为尿苷二磷酸葡萄糖、尿苦二鱗酸半乳糖、尿香二鱗酸-N-乙醜葡糖胺或尿普二鱗酸-N-乙酰半乳糖胺。
4.根据权利要求1所述的一种糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述糖选自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺。
5.根据权利要求1所述的一种糖核苷酸的制备方法，其特征在于，所述微生物是酿酒酵母或马克斯克鲁维酵母。
【专利摘要】本发明公开了一种糖核苷酸的制备方法，该方法包括如下步骤：选择微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，其中所述微生物属于酵母属或克鲁维酵母属且具有从核鲁酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力，所述核苷酸前体选自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸，核苷以及尿苷；在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，其浓度为0.2-0.4Mm,反应pH值为6.5-7.5，使用氢氧化钠溶液调节pH，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸；并从该水性介质中提取糖核苷酸。本发明不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高价的原料，而可利用乳清酸等廉价的核苷酸前体物质及糖为原料，不必添加高价的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶，无需酶的分离操作，制作简单，效率高。
【IPC分类】C12P19-30, C12R1-645, C12R1-865
【公开号】CN104694598
【申请号】CN201510071303
【发明人】戴祖新
【申请人】海门市润圣纺织品有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月11日