一种固态发酵制备β-胡萝卜素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及利用三孢布拉氏霉菌固态发酵胡萝卜素 的方法。
【背景技术】
[0002] 0 _胡萝卜素分子式为C4(IH55，一种有效的生理抗氧化剂，具有抗衰老防治心血管 疾病、抗肿瘤、增强机体特异性和非特异性免疫功能、调节炎症反应防辐射增加细胞与细胞 间的缝间连接交流等功效，并且其作为维生素原可防止由于维生素A缺乏而引起夜盲症， 可以促进上皮细胞的正常成熟，同时也是理想的食品着色剂和营养增补剂。
[0003] 目前，生产胡萝卜素的方法主要有三种，即化学合成法，天然物提取法及微生 物发酵法。其中微生物发酵法具有生产稳定，受季节、气候、时间和地域因素影响小，生产 周期较短，质量控制相对比较容易等优势，日益为研宄人员和生产企业所关注。目前，国内 外已经对分离得到的产胡萝卜素微生物进行了系统的比较和研宄，并通过诱变筛选和 发酵研宄，发现了一些有应用价值的微生物菌株，其中，三孢布拉氏霉菌由于生产及所获 0-胡萝卜素应用安全，生物量大，胡萝卜素产量高等优势，成为生物发酵法制备天然 0-胡萝卜素的主要工业应用菌株（CN103484520A)。
[0004] 通过文献检索发现，当前国内外对三孢布拉氏霉菌产0-胡萝卜素的发酵的研宄 集中于液体发酵方式，又名深层发酵或通气搅拌发酵方式，其特点是使用液体培养基，在摇 床上振摇培养，或置于发酵罐中，搅拌下通入无菌空气，使菌丝在液体培养基中生长并产生 0-胡萝卜素。由于胡萝卜素几乎不溶于水，因此在发酵过程中胡萝卜素是沉积 在菌丝体内的，需要收集菌丝体，然后从中提取胡萝卜素。在传统胡萝卜素液体发 酵的工艺中，要提高产量需要从两个方面着手：1)提高发酵液中菌丝体的含量（生物量）； 2)提高菌丝体中胡萝卜素的含量；但是不管哪一方法，都需要对发酵产物进行过滤或 离心处理，收集菌体，烘干后再进行提取，过滤或离心后得到的大量含水液体则作为废液被 遗弃。
[0005] CN103484520A公开了一种采用发酵促进剂强化胡萝卜素发酵工艺，将发酵培养 基置于230rpm的摇床上发酵培养，通过添加促进剂如水杨酸等提高发酵水平，产量可达 2. 25克/升以上。
[0006] CN102787158A公开了一种发酵法生产0 -胡萝卜素的方法，将三孢布拉氏霉菌孢 子悬浮液接种于发酵罐中发酵制备菌丝体，发酵液用有机碱调节至碱性，过滤后得到湿菌 体，用疏水性有机溶剂处理菌丝体，然后用酯类有机溶剂萃取菌丝体中的胡萝卜素。
[0007]CN102757995A公开了一种利用三孢三孢布拉氏霉菌发酵制备胡萝卜素的 方法，使用含麸皮浸出液、麦芽糖、硫酸镁等的液体培养基发酵，可获得胡萝卜素含量 较高的菌丝体，菌丝体干重可达21. 5g/L~32. 5g/L，干菌丝体中0 -胡萝卜素含量可达 2. 6%~4. 8% (w/w)
[0008][0009] CN1193048A公开了一种方法：通过在气升式发酵罐中培养三孢布拉霉菌的正、负 菌株，发酵生产胡萝卜素，产量可达1.5g/L。
[0010] 上述专利中所用的方法均使用液体发酵培养基，需要消耗较多的水资源，且会产 生大量的发酵废液。
【发明内容】
[0011] 本发明公开了一种利用三孢布拉氏霉菌发酵胡萝卜素的方法，其特征是用固 体发酵培养基代替传统工艺中的液体发酵培养基，培养发酵后，获得的含菌丝体固体发酵 物可以直接减压干燥，用于提取其中的胡萝卜素。相比于液体发酵，减少了过滤或离心 获得菌丝体的工序，大幅度减少了工艺中所用的水量和废水的排放，有利于保护我国有限 的淡水资源，尤其适宜于在我国北方缺水地区推广和应用。
[0012] 本发明的方法包括：包括：用三孢布拉氏霉菌接种先经种子培养，再接种到培养 基中，发酵后收集菌体，提取，即得，其中培养基为疏松多孔的固体培养基，菌种为三孢布拉 氏霉菌（+)菌（ATCC 14059,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）和三孢布拉氏霉菌 (一）菌（ATCC 14060,购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）。
[0013] 其中菌种在固体培养基上发酵培养时间优选5-8天，发酵温度优选24~28°C。
[0014] 所述固体发酵培养基的组成优选：小米含量为30~50%、麸皮含量为2~10%、 豆油含量为5~20%、吐温80为5~20%，余量为谁，百分比为重量百分比。
[0015] 最优选的用于发酵的固体培养基：每公斤固体发酵培养基由小米400g、麸皮50g、 豆油100g、吐温80为100g、黄豆饼粉10g，加水至lkg混合制成。
[0016] 本发明中三孢布拉氏霉菌（+)菌和三孢布拉氏霉菌（一）菌接种到固体培养基上 的重量比比例优选1:5~1:8。更优选1:7。
[0017] 所述的种子培养可以用常规方法，优选：将三孢布拉氏霉菌（+)菌和（一）菌分别 接种于PDA (土豆琼脂培养基）平皿中，26°C静置培养40~50h，菌丝即铺满平皿。
[0018] 发酵后收集培养物，产物0-胡萝卜素的提取方法可以参考文献提取，优选的方 法如下：固体培养物在60°C下减压干燥，粉碎后用2倍体积乙酸乙酯浸提其中的0 -胡萝 卜素，分别提取3次，合并提取液，可得含胡萝卜素的提取液。进一步可以通过减压浓 缩，真空干燥获得胡萝卜素粗品
[0019] 本发明直接使用固体培养基发酵获得菌丝体，避免了液体发酵离心或过滤获得菌 丝体的工序，减少了水资源的浪费，并且整个工艺过程中几乎无废水排放，对环境污染小， 尤其适合于在我国北方缺水的地区推广应用。本发明还优选了适合发酵使用的固体培养基 和发酵条件，产量可达8. 3g/kg，是常规固体培养基如PDA发酵产量（0. 56g/kg)的14. 8倍， 是麸皮固体培养基产量（〇. 34g/kg)的24. 4倍，也高于液体发酵的3. 0g/kg产量，详细对比 结果参见表1。
[0020] 对比试验：
[0021] 分别以液体培养方式（对照1)、固体PDA培养基发酵（对照2)、麸皮固体培养基 发酵（对照3)作为参照，比较了不同发酵方式以及培养条件对产量和工艺的影响。
[0022] 对照1 :培养基为液体发酵培养基，组成为小米粉8%、葡萄糖2%，植物油8%、 KH2P04 0 . 05%、KC1 0.05%、吐温-80 10%，pH 7.0〇
[0023] 对照2 :固体PDA培养基，制备方法为去皮土豆200g，切碎后加1L水煮沸20min， 用8层纱布过滤后去滤液，加入20g葡萄糖，琼脂粉20g，灭菌后倾倒平皿制备。
[0024] 对照3 :麸皮固体培养基，组成为麸皮360g，玉米粉140g，水500g，加热搅匀后灭菌 备用。
[0025] 技术例1 :固体培养基A，组成为小米400g、麸皮50g、豆油100g、吐温80为100g、 黄豆饼粉 l〇g，KH2P040. 5g、KC1 0? 5g 加水至 lkg。
[0026] 技术例2 :固体培养基B，组成为小米350g、麸皮60g、豆油80g、吐温80为120g、黄 豆饼粉 20g，KH2P040. 5g、KC1 0? 5g，加水至 lkg。
[0027] 将三孢布拉氏霉菌将（+)菌和（一）菌种子按照1:7比例或1:6比例（仅技术例 2中使用）接种到发酵培养基中并混匀，除对照1放摇床中220rpm振荡培养外，其余均置 26°C静止培养5-7天。液体发酵后产物离心收集离心收集菌丝体，固体发酵直接收集发酵 产物，置60°C真空干燥箱中烘干。干菌体研磨后用乙酸乙酯浸取，提取其中的胡萝卜 素，HPLC法测定，结果如表1所示：
[0028] 表1不同发酵条件比较
【主权项】
1. 一种制备e-胡萝卜素的方法，包括：用三孢布拉氏霉菌先经种子培养，再接种到培 养基中，发酵后收集菌体，提取，即得，其特征是，其中培养基为疏松多孔的固体培养基，菌 种为三孢布拉氏霉菌（+)菌和三孢布拉氏霉菌（一）菌。
2. 权利要求1的方法，其中菌种在固体培养基上发酵培养5-8天，发酵温度为24~ 28。。。
3. 权利要求1的方法，其中固体培养基中小米含量为30~50%、麸皮含量为2~10%、 豆油含量为5~20%、吐温80为5~20%，KH2P040 . 01~0? 1%、KC1 0.01~0? 1%，余量 为水，所述百分比为重量百分比。
4. 权利要求3的方法，其中每公斤固体培养基由小米400g、麸皮50g、豆油100g、吐温 80为100g、黄豆饼粉10g、KH2PO4O. 5g、KCl0. 5g，加水至Ikg混合制成。
5. 权利要求1的方法，其中三孢布拉氏霉菌（+)菌和三孢布拉氏霉菌（一）菌接种到 固体培养基上的重量比比例为1:5~1:8。
6. 权利要求5的方法，其中三孢布拉氏霉菌（+)菌和三孢布拉氏霉菌（一）菌接种重 量比为1:7。
7. 权利要求1的方法，其中种子培养包括：将三孢布拉氏霉菌（+)菌和（一）菌分别接 种于PDA平皿中，26°C静置培养40~50h，即得。
8. 权利要求1的方法，其中收集菌体后产物0 -胡萝卜素的提取方法为：固体培养物 在60°C下减压干燥，粉碎后用乙酸乙酯浸提其中的0-胡萝卜素。
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，具体涉及利用三孢布拉氏霉菌固态发酵β-胡萝卜素的方法。其特征是用固体发酵培养基代替传统工艺中的液体发酵培养基，培养发酵后，获得的含菌丝体固体发酵物可以直接减压干燥，用于提取其中的β-胡萝卜素。相比于液体发酵，减少了过滤或离心获得菌丝体的工序，大幅度减少了工艺中所用的水量和废水的排放，有利于保护我国有限的淡水资源，尤其适宜于在我国北方缺水地区推广和应用。
【IPC分类】C12R1-645, C12P23-00
【公开号】CN104694607
【申请号】CN201510107564
【发明人】郑珩, 李凌云, 劳兴珍, 余永柱, 张彦, 成欣
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年3月12日