一种坦布苏病毒纳米pcr检测试剂盒及其检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及坦布苏病毒的检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 2010年4月份以来，我国南方部分地区爆发了以蛋鸭产蛋严重下降为主要特征的 新的急性传染病。该病临床症状以高热、蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征，剖检可见病死鸭 肝脏肿大，有白色点状出血点，卵泡变性，卵泡膜充血、出血。该病发病率几乎100 %，死亡 率可达59^10%，给蛋鸭养殖业造成了巨大的经济损失。目前已证实，该传染病的病原为坦 布苏病毒（tembusuvirus，TMUV)。TMUV属于黄病毒科黄病毒属成员，该病毒也可以感染其 他水禽以及蛋鸡，引发相同的临床表现。
[0003] TMUV的检测方法主要包括传统的病毒分离、环介导等温扩增、聚合酶链式反应 (PCR)等，这些方法在病毒检测中发挥了重要作用。其中PCR检测方法由于操作简单，灵敏 性高、重复性好等优点被广泛应用。但在实际应用中，PCR技术存在诸多局限性，例如对复 杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率不够高等问题。为解决以上问题，寻 找可以提高PCR特异性和效率的添加剂显得极其重要。
[0004] 纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为lnm~100nm的固相纳 米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。由于纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加 了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的 停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，减少非特性扩增，提高特异性扩增 产量。因此，目前亟需建立一种能够快速、特异的检测坦布苏病毒的纳米PCR检测手段。
【发明内容】
[0005] 本发明针对上述现有技术的不足，提供了一种用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试 剂盒及其应用，该试剂盒能够快速、特异的检测坦布苏病毒。
[0006] 本发明所采取的技术方案是：一种用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括 5X反转录缓冲液、dNTPMixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述 试剂盒还包括2XNanoPCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo. 1 所示，所述下游引物的序列为SEQIDNo. 2所示。
[0007] 引物是根据GenBank公布的坦布苏病毒序列，在其E基因保守序列区域设计的一 对特异性引物。
[0008] 优选的，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture组 成。
[0009] 优选的，反转录酶为M-MLV反转录酶。
[0010] 优选的，反转录引物的序列为SEQIDNo. 2所示。
[0011] 优选的，所述试剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75% 乙醇。
[0012] 优选的，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0013] 其中，阳性对照可为将坦布苏病毒接种9-11日龄鸡胚后，收集72~96小时死亡 鸡胚的尿囊液。
[0014] 本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有坦布苏病毒的产 品中的应用。
[0015] 应用所述试剂盒检测待测样品中是否含有坦布苏病毒的方法，包括如下步骤： 1、病毒RNA的提取 (1)将250yL经过预处理的待测样品加入750yLTRIzolLSReagent中，剧烈振荡 2min，室温放置5min。加入250yL氯仿，剧烈振荡lmin，室温放置5min后，4°C12,000 rpm离心15min，将上层水相转入新的离心管。（2)加入与水相等体积的异丙醇，混勾，室温 静置15min，4°C12, 000rpm离心15min，轻轻倒去上清，然后加入DEPC处理的75%乙醇 700~800yL，4°C12,000rpm离心5min，弃上清。（3)将沉淀自然风干或于50°C干燥箱 中晾干，用适量无核酸酶水充分溶解后立即进行PCR或贮存于-80°C备用。
[0016] 待测样品可为鸡、鸭与鹅的卵巢、输卵管、脾脏、肝脏等组织。其中，待测样品预处 理的方法为：将待测样品剪碎后，按照1:5的质量体积比加入生理盐水并研磨均匀，3000~ 5000rpm离心5~10分钟后取上清，之后再进行RNA的提取。
[0017] 反转录反应 取上述步骤所得的病毒总RNA11yL，加入2yL10剛的反转录引物（SEQIDNo. 2)， 4yL5X反转录缓冲液、0. 5yL反转录酶、0. 5yLRNA酶抑制剂、2yLdNTPMixture 至20yL，42°C水浴1~2h，即得到cDNA溶液。
[0018] 2、纳米PCR反应 在反应管中加入10 yL2XNanoPCRMix、l yL上述cDNA溶液、0.5 yL10剛的上游 引物（SEQID No. 1)、0. 5 yL 10MM的下游引物（SEQID No. 2)，最后加入无核酸酶水至总 体积为20yL。
[0019] 混匀后按如下反应程序进行：94°C3min，l个循环；94°C10s，55°C30s，72°C 20s，共30个循环；72°C5min1个循环。反应结束后，经1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩 增产物，若出现348bp大小的条带则待测样品含有坦布苏病毒。
[0020] 本发明提供了一对检测坦布苏病毒的特异性引物，利用其制成的纳米PCR试剂 盒，能够快速、特异的检测坦布苏病毒。本发明可使PCR反应更快地达到目标温度，减少了 在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时间，大大提高了坦布 苏病毒的检测效率，并有效提高了坦布苏病毒的特异性扩增产量，减少了非特异性扩增，具 有很好的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1为坦布苏病毒纳米PCR检测结果； M:DL2000Marker ;1:阳性对照； 图2为坦布苏病毒纳米PCR敏感性检测结果； M: DL2000 Marker ;1~5依次为10°~1(T4倍比稀释病毒核酸的扩增产物；6:阴性对 昭. 图3为坦布苏病毒纳米PCR特异性检测结果。
[0022] M:DL2000Marker;1:坦布苏病毒；2:鸭瘟病毒；3:鸭肝炎病毒；4 :乙型脑炎病 毒；5 :禽流感病毒；6 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0023] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所 给出的例子。下述实施例中所使用的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例 中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0024] 实施例1一种检测坦布苏病毒的纳米PCR试剂盒最佳实施例 本实施例试剂盒包括：（1)坦布苏病毒RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙 醇、75%乙醇；（2)反转录试剂：5X反转录缓冲液、浓度为2. 5mM的dNTPMixture、浓度为 2. 5U/yL的M-MLV反转录酶、浓度为30U/yL的RNA酶抑制剂和反转录引物；（3)纳米 PCR反应试剂：2XNanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4)其他：阳性对照和无核酸酶水。 其中，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture组成，阳性对照 为将坦布苏病毒接种9-11日龄鸡胚后，收集72~96小时死亡鸡胚的尿囊液，引物为冻干 粉，HPLC纯。本实施例试剂盒包含的引物序列见表1。
[0025] 表1引物序列
【主权项】
1. 一种用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，包括5X反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2XNanoPCR Mix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列为SEQIDNo.1所示，所述下游引物的序列 为SEQIDNo.2 所示。
2. 根据权利要求1所述的用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述 2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture组成。
3. 根据权利要求1所述的用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述反 转录酶为M-MLV反转录酶。
4. 根据权利要求1所述的用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述反 转录引物的序列为SEQIDNo. 2所示。
5. 根据权利要求1所述的用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试 剂盒还包括RNA提取试剂：TRIzolLSReagent、氯仿、异丙醇、75%乙醇。
6. 根据权利要求1所述的用于坦布苏病毒检测的纳米PCR试剂盒，其特征在于所述试 剂盒还包括阳性对照。
7. 如权利要求1~6任一项所述的试剂盒在制备检测待测样品中是否含有坦布苏病 毒的产品中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种坦布苏病毒纳米PCR检测试剂盒及其检验方法。所述试剂盒包括5×反转录缓冲液、dNTP Mixture、反转录酶、RNA酶抑制剂和反转录引物，其特征在于所述试剂盒还包括2×NanoPCR Mix、上游引物和下游引物，其中，上游引物的序列为SEQ ID No.1所示，下游引物的序列为SEQ ID No.2所示。该试剂盒可用于检测坦布苏病毒。本发明还提供了一种采用前述试剂盒进行坦布苏病毒检测的方法，能够快速、特异的检测坦布苏病毒，大大提高了坦布苏病毒的检测效率及坦布苏病毒的特异性扩增产量。
【IPC分类】C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104711371
【申请号】CN201510127376
【发明人】袁万哲, 刘聚祥, 孙继国, 陈立功, 刘静, 王庚南
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月23日