5,5’-去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物催化和生物转化领域，具体涉及一种5, 5' -去氢二香草乙酮的漆 酶催化合成方法。
【背景技术】
[0002] 香草乙酮是从植物体内分离出来的一种活性物质，可特异性地抑制NADPH氧化酶 活性，具有抗氧化和抗炎活性，并被用于治疗帕金森症。在自然界，5,5' -去氢二香草乙酮 (Dehydrodiacetovanillone，CAS :29799-22-2)是香草乙酮的代谢产物，是超氧阴离子的捕 获剂，被认为比香草乙酮具有更高的活性，但该产品在生物体内仅微量存在。
[0003] 目前以香草乙酮为原料合成5, 5'-去氢二香草乙酮的方法主要有两种。一种是化 学法，采用过硫酸盐为氧化剂，以硫酸亚铁为引发剂，在100° C时反应5min。反应结束时， 产物因不溶于水而沉淀下来，但同时一些铁盐、过硫酸盐和硫酸盐也会一起沉淀下来。后续 需要用NH 4OH或NaOH溶液将沉淀物重新溶解，再用HCl溶液进行再沉淀，以去除杂质，最后 用沸水多次洗涤沉淀，产物得率约为60%。该工艺中，由于过硫酸盐氧化性较强，经常会造成 侧链断裂，从而形成低分子量物质；同时可能会有三聚体生成。可见，化学合成法虽然反应 时间短，但后续纯化较为复杂，需要消耗较多酸碱等化学药品，同时所得产品纯度和得率均 较低。另外一种合成少量5, 5' -去氢二香草乙酮的方法是利用过氧化物酶，最典型的是利 用辣根过氧化物酶，以H2O2为氧化剂，在pH=4时反应，通过过滤洗涤，得到产品。
[0004] 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，氧化还原电位较低，可氧化单酚、双酚、氨基酚和 芳香胺化合物，可以直接以O 2为电子传递体实现氧化还原作用，反应后唯一的副产物就是 水。重组漆酶是利用分子生物技术，通过基因重组表达制备得到的产品，具有纯度高、活性 尚、氧化还原电位尚等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种环境友好的、工艺简单、效率高、生产成本低的漆酶催化制备 5, 5' -去氢二香草乙酮的方法，为其进一步的生产及应用奠定基础。
[0006] -种5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，包括如下步骤： (1) 将香草乙酮溶解于水或pH为3. 5~6.0的缓冲溶液中，配制成溶液，控制温度在 20~60° C，加入重组漆酶，于摇床中反应； (2) 反应结束后静置沉淀，洗涤沉淀物，于不高于50°C下干燥，得到产品5, 5' -去氢二 香草乙酮。
[0007] 步骤（1)中，所述的香草乙酮溶液的摩尔浓度为33 mmol/L ;摇床转速为120~150 rpm，反应时间大于4 h ;所述重组漆酶用量为3. 0~6. 0 U/mol香草乙酮。
[0008] 步骤（1)中，所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠、磷酸-磷酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、酒 石酸-酒石酸钠、琥珀酸-琥珀酸钠、丙二酸-丙二酸钠水溶液中的一种。
[0009] 与现有技术相比，本发明的优点是： 1. 反应原料和重组漆酶本身均为天然产物，无毒，反应过程中利用空气中的氧，不需要 添加其他氧化剂； 2. 反应条件温和，室温下即可进行； 3. 产物单一，易于纯化，纯化步骤中不涉及酸碱等化学药剂，产品纯度高。
【附图说明】
[0010] 图1是原料香草乙酮（a)和实施例1 (b)、实施例2 (C)产品的HPLC图。
【具体实施方式】
[0011] (3)本发明的重组漆酶按参考文献（Xie，H. F.，Li, Q.，Wang, Μ. M.，and Zhao, L. G. (2013) Production of a Recombinant Laccase from Pichia pastoris and Biodegradation of Chlorpyrifos in a Laccase/Vani11 in System, J Microbiol 沒864-871.)中方法制备并纯化。
[0012] 本发明所采用的漆酶酶活的测定方法为：采用1cm光程比色皿，利用紫外分光光 度计进行测量，检测波长为465nm。缓冲液为50mM的pH 5. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液， 2mL反应体系中含有I. 8 mL缓冲液，0. 9 mL 2. 5 mM愈创木酚溶液和0.1 mL经过一定稀 释的漆酶。测定在30° C进行，记录3 min吸光度A的变化，计算得到平均每分钟吸光度 的变化值Δ A，按下式计算漆酶活性，其中吸光系数为1. 2 ' IO4 if1 X cnT1:
【主权项】
1. 一种5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将香草乙酮溶解于水或pH为3. 5~6.O的缓冲溶液中，配制成溶液，控制温度在 20~60°C，加入重组漆酶，于摇床中反应； (2) 反应结束后静置沉淀，洗涤沉淀物，于不高于50°C下干燥，得到产品5, 5' -去氢二 香草乙酮。
2. 如权利要求1所述的5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，所 述的香草乙酮溶液的摩尔浓度为33mmol/L。
3. 如权利要求1所述的5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，摇 床转速为120~150rpm，反应时间大于4h。
4. 如权利要求1所述的5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，重 组漆酶用量为3. 0~6. 0U/mol香草乙酮。
5. 如权利要求1所述的5, 5' -去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法，其特征在于，缓 冲液选自醋酸-醋酸钠、磷酸-磷酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、酒石酸-酒石酸钠、琥珀酸-琥 珀酸钠、丙二酸-丙二酸钠水溶液中的一种。
【专利摘要】本发明公开了一种5,5’-去氢二香草乙酮的漆酶催化合成方法。包括如下步骤：将香草乙酮溶解于水或pH为3.5~6.0的缓冲溶液中，配制成溶液，控制温度在20~60°C，加入重组漆酶，于摇床中反应；反应结束后静置沉淀，洗涤沉淀物，于不高于50℃下干燥，得到产品5,5’-去氢二香草乙酮。本发明的反应原料和重组漆酶本身均为天然产物，无毒，反应过程中利用空气中的氧，不需要添加其他氧化剂；本发明反应条件温和，室温下即可进行，产物单一，易于纯化，纯化步骤中不涉及酸碱等化学药剂，产品纯度高。
【IPC分类】C12P7-26
【公开号】CN104726504
【申请号】CN201510142163
【发明人】谢慧芳, 赵林果, 李琦, 惠娟, 沈锦优
【申请人】南京理工大学, 南京林业大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月27日