一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，更具体的说，本发明涉及一种邻苯二甲酸二辛 酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二（α -乙基己）酯（Di (2-ethylhexyl) phthalate)，英文缩写 DEHP, 又名邻苯二甲酸二辛酯，分子量为390. 5, 25°C时该品在水中溶解度〈0.01%，溶于大多数 有机溶剂和烃类，其结构式为：
[0003]
【主权项】
1. 一种DEHP半抗原，特征在于分子结构式为：
η为1~6的自然数。
2. -种DEHP人工抗原，是由权利要求1所述的DEHP半抗原与载体蛋白结合而成，其特 征在于：所述DEHP人工抗原分子结构式为：
η为1~6的自然数；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。
3. 如权利要求1所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于包括以下步骤： (1)按投料比为3:1将浓硝酸与DEHP置于圆底烧瓶中，冰浴条件下滴加到2倍于浓硝 酸量的浓硫酸中，磁力搅拌，反应至室温，再60°C回流反应5h，期间用TLC监控。用ImoL/ L的氢氧化钠溶液中和反应液至弱碱性，乙酸乙酯萃取3次，有机相于旋转蒸发仪上减压蒸 干得到粗的硝化产物DEHP-NO2，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为2:1~3:1的氯仿/环己烷 洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的硝化产物DEHP-NO 2 ; ⑵按投料比为1:2:2将DEHP-N02、NH4CU铁粉置于圆底烧瓶中，添加到适量的70% 乙醇溶液中，磁力搅拌，50°C回流反应5h，期间用TLC监控；反应结束后，向反应液中加入 IOOmL无水乙醇，滤去铁粉，收集滤液，于旋转蒸发仪浓缩近干；向浓缩液中加30mL水，用乙 酸乙酯萃取3次，收集有机相，蒸干，得到粗产物DEHP-NH 2 ;过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为 5:1~4:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的还原产物DEHP-NH 2 ; (3)按投料比为1:2~1:3将DEHP-NH2与卤代酸盐置于圆底烧瓶中，并将其混合物用 少量的无水乙醇溶解，同时加入与卤代酸盐等量的碳酸钾，在60°C下回流反应，在反应过程 中加入适量的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应5h后，停止反应，过滤反应混合物得到黄 棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为4:1~5:1的氯仿 /甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到产物即为目标半抗原。
4. 根据权利要求3所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于：所述的卤代酸盐为卤代 酸钠，其结构式为R-(CH2) n-COONa,其中R可为Cl或Br, η = 1~6。
5. 如权利要求2所述DEHP人工抗原的制备方法为活泼脂法与混合酸酐法，其特征在 于： 所述活泼酯方法为： (1) 将0.1 mmol的DEHP半抗原溶解于ImL的DMF中，然后在该溶液里加入等摩尔的DCC 和NHS，室温避光反应过夜； (2) 4°C离心去除沉淀，取上清液，并将其缓慢加入到5mL ρΗ9. 5的碳酸缓冲液中，其缓 冲液含有载体蛋白BSA或OVA，其中载体蛋白的浓度为10~15mg/mL，在4°C下反应过夜； (3)将步骤（2)中的反应液装入透析袋，用0.9%的生理盐水透析3d，得到人工抗原； 所述混合酸酐法为： (1) 将0.1 mmol DEHP半抗原溶于ImL DMF中，加入80 μ L正三丁胺，冰浴下缓慢滴加 0. 15mmol氯甲酸异丁酯，4°C搅拌反应Ih,此为甲液； (2) 将60mg载体蛋白BSA或OVA溶于5mLlmol/L pH9. 6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙 液； (3) 将甲液缓慢滴加到乙液中，4°C磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然 后用0. 9 %的生理盐水透析3d，得到人工抗原。
6.如权利要求2所述的DEHP人工抗原的应用，其特征在于，所述的DEHP人工抗原应用 于制备抗DEHP多克隆抗体或单克隆抗体的制备。
【专利摘要】本发明是关于一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及应用，属于免疫学检测技术领域。本发明以DEHP为原料，经硝化反应和还原反应，制得带氨基基团的中间产物，再与卤代酸盐等试剂反应生成带羧基基团的半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原。该人工抗原可用于动物免疫制备抗DEHP的特异性抗体，对建立检测DEHP的ELISA分析方法，具有重要现实意义。
【IPC分类】G01N33-577, C07C229-62, G01N33-535, C07K14-77, C07K14-795, C07K16-44, C07K14-765, C07C227-18, C07K1-107
【公开号】CN104744285
【申请号】CN201410336147
【发明人】张挺
【申请人】广州城市职业学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年7月15日