茄子查尔酮异构酶SmCHI蛋白及其编码基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及茄子花青素合成途径中的关键酶及其编码基因，具体涉及一种茄子查 尔酮异构酶SmCHI蛋白及其编码基因，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 人体内由于新陈代谢活动不可避免的会产生大量自由基，花青素作为一种强还原 性物质，能够清除人体内的自由基，延缓机体衰老。花青素的合成途径是类黄酮合成途径的 一部分，也是目前研宄的非常广泛而深入的植物次生代谢途径，其在主要模式植物如拟南 芥、矮牵牛中已被详细阐述。花青素的生物合成主要分为三个阶段：第一阶段由苯丙氨酸到 香豆酰CoA，这是许多次生代谢共有的步骤；第二阶段由香豆酰CoA到二氢黄酮醇，这是类 黄酮代谢的关键步骤，它合成花青素和其他黄酮物质的前体；第三阶段是各类花青素的合 成。
[0003] 查尔酮异构酶是催化类黄酮合成途径中的第二个关键酶，将查尔酮环化形成花青 素的骨架黄烷酮。该反应的一个重要特点是将黄色的查尔酮转变成了无色黄烷酮。植物的 这一步反应在没有CHI的情况下也可自发进行，但在CHI的催化下反应速率是自发进行的 1〇7倍。应用基因工程技术将CHI基因导人到植物中，其表达产物可以促进有益于人体健康 的黄酮类化合物的生物合成，改变花色、果色，改善口感等，具有很大的开发应用的前景。将 康乃馨花瓣中的CHI基因突变，会使白色的花朵变成黄色；将矮牵牛CHI基因转入番茄中， 其果皮中黄酮类含量增加了 78倍，果肉中黄烷醇增加了 21倍。将CHS正义基因和CHI反 义基因导人到甜橙中，苦味物质的合成量减少，口感更好了。
[0004] 目前已从很多植物中克隆得到CHI基因，如拟南芥、苹果、矮牵牛、葡萄、大豆等。 茄子是花青素含量最为丰富的蔬菜作物之一，但对于茄子CHI基因的克隆、表达模式及其 启动子序列目前尚不清楚。目前，未有任何与茄子CHI基因及其编码蛋白的相关文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补茄子CHI家族成员的克隆、表达模式分析以及茄子CHI蛋 白及其编码基因的空白。本发明提供了一种茄子CHI的cDNA、gDNA以及氨基酸序列；进一 步地，本发明提供了茄子SmCHI基因的亚细胞定位，还提供了茄子SmCHI基因在不同组织器 官及低温下的表达模式。本发明还提供了SmCHI基因的启动子序列及其元件分析。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质，其包括：
[0008] (a)由如SEQIDN0. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
[0009] (b)在（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄 子查尔酮异构酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
[0010] 作为优选方案，所述蛋白质包括SEQIDN0. 3所示氨基酸序列经过1~50个氨基 酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到 的氨基酸序列。
[0011] 作为优选方案，所述蛋白质为SEQIDN0. 3所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被 性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0012] 第二方面，本发明提供了一种编码权利要求1所述的具有茄子查尔酮异构酶活性 的蛋白质的基因的核酸序列，所述基因的gDNA序列如SEQIDN0. 2所不。
[0013] 作为优选方案，所述基因的cDNA序列包括：
[0014] (a)如SEQIDNO. 1第1~705位所示的碱基序列；或
[0015] (b)与SEQIDNO. 1第1~705位所示的碱基序列具有至少70%的同源性的碱基 序列；或
[0016] (C)能与SEQIDNO. 1第1~705位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
[0017] 作为优选方案，所述核酸序列包括SEQIDNO. 1第1~705位所示的核酸序列中 1~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸。[0018] 第三方面，本发明提供了一对用于扩增权利要求4所述基因的核酸序列的gDNA的 引物，所述引物的序列如SEQIDN0. 7和SEQIDN0. 8所示。
[0019]第四方面，本发明提供了一对用于扩增权利要求4或5所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列如SEQIDN0. 5和SEQIDN0. 6所示。
[0020] 第五方面，本发明还提供了一种具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质的基因的核 酸序列的启动子，所述启动子包括SEQIDN0. 4中所示的碱基序列。
[0021] 在本发明中，"分离的DNA"、"纯化的DNA"是指，该DNA或片段已从天然状态下位 于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开， 而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0022] 在本发明中，术语"SmCHI蛋白编码序列"指编码具有茄子SmCHI蛋白活性的多肽 的核苷酸序列，如SEQIDNO. 1所示的第1~705位核苷酸序列及其简并序列。该简并序 列是指，位于SEQIDNO. 1所示的第1~705位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同 氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO. 1 所示的第1~705位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO. 3所 示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列的同源性至少70%的核 苷酸序列。
[0023] 该术语还包括能编码具有与天然的茄子SmCHI相同功能的蛋白的SEQIDNO. 1所 示序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~90个核苷酸的缺失、 插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加为60个以内核苷酸。
[0024] 在本发明中，术语"SmCHI蛋白"指具有茄子SmCHI蛋白活性的SEQIDN0. 3所示 序列的多肽。该术语还包括具有与茄子SmCHI蛋白相同功能的、SEQIDNO. 3序列的变异 形式。这些变异形式包括（但并不限于）：通常为1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能 相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括茄子SmCHI蛋白 的活性片段和活性衍生物。
[0025] 本发明的茄子SmCHI蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异 体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与茄子SmCHI相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用茄子SmCHI蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0026] 在本发明中，"茄子SmCHI保守性变异多肽"指与SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序列 相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异 多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0027]表1
【主权项】
1. 一种具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质，其特征在于，包括： (a) 由如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子查 尔酮异构酶活性的由（a)衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质，其特征在于，所述蛋 白质包括SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或 者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的氨基酸序列。
3. 根据权利要求1或2所述的具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质，其特征在于，所述 蛋白质为SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所 替换而形成的序列。
4. 一种编码权利要求1所述的具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质的基因的核酸序 列，其特征在于，所述基因的gDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
5. 根据权利要求4所述的编码所述具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质的基因的核 酸序列，其特征在于，所述基因的cDNA序列包括： (a) 如SEQ ID NO. 1第1~705位所示的碱基序列；或 (b) 与SEQ ID NO. 1第1~705位所示的碱基序列具有至少70 %的同源性的碱基序列； 或 (c) 能与SEQ ID NO. 1第1~705位所示的碱基序列进行杂交的碱基序列。
6. 根据权利要求5所述的具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质的基因的核酸序列，其 特征在于，包括SEQ ID NO. 1第1~705位所示的核酸序列中1~90个核苷酸的缺失、插 入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的碱基序列。
7. -对用于扩增权利要求4所述基因的核酸序列的gDNA的引物，所述引物的序列如 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。
8. -对用于扩增权利要求4或5所述基因的核酸序列的cDNA的引物，所述引物的序列 如 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 所示。
9. 一种权利要求4所述的具有茄子查尔酮异构酶活性的蛋白质的基因的核酸序列的 启动子，其特征在于，所述启动子包括SEQ ID NO. 4中所示的碱基序列。
【专利摘要】本发明公开一种茄子查尔酮异构酶SmCHI蛋白及其编码基因，所述蛋白包括：(a)由如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子查尔酮异构酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述编码基因的cDNA和gDNA分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示碱基序列；该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，果皮中的表达量显著高于其他组织。低温胁迫下，其表达量在48h达到最大值，为未处理的3.65倍。本发明为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-61, C12N9-90, C12N15-11
【公开号】CN104745561
【申请号】CN201510112447
【发明人】陈火英, 蒋明敏, 任丽, 高莉洁, 周腾夏
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月13日