一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶。
【背景技术】
[0002] 精氨酸是供给生物体合成绝大部分多肽及蛋白质的重要氨基酸。正常细胞所需 精氨酸可经体内的尿素循环由精氨琥泊酸合成酶（argininosuccinatesynthetase,ASS) 与精氨琥泊酸裂合酶（argininosuccinatelyase，ASL)共同作用催化瓜氨酸而生成。 而一些肿瘤细胞，因其缺少ASS而自身无法正常合成精氨酸，必须从外部环境中摄取精 氨酸以进行生长繁殖，这一类细胞被称之为精氨酸营养缺陷型肿瘤细胞，例如肝癌细胞 (hepatocellularcarcinomas,HCCs)和黑素瘤细胞（melanomas) 〇
[0003] 恶性黑素瘤和肝癌是在诊断一年内杀死大多数患者的致命性疾病。其发病率正迅 速地增长，在其他国家其增长速率甚至更高。在世界上肝炎流行的地方，肝癌的发病率更 高。急需对这些疾病进行有效治疗。
[0004] 已有用选择性去除必需氨基酸的方法来治疗某些癌症。比如通过分解精氨酸对肿 瘤细胞进行营养剥夺的精氨酸酶。精氨酸酶体外抗肿瘤活性自1960年已有报道（Bach，S. J. ,R.A.Hawkins,andD.Swaine.〃Ashortmethodforthepurificationofarginase fromoxliver."BiochemicalJournal89. 2 (1963): 263.)。虽然精氨酸酶的体外抑瘤作 用明确，但将其用于体内试图通过精氨酸耗竭治疗癌症的多项研宄并没有取得预期的效 果（Storr,J.M.，andA.F.Burton.〃Theeffectsofargininedeficiencyonlymphoma cells."Britishjournalofcancer30. 1(1974):50.)，这是因为机体应对氨基酸缺乏时 存在体内氨基酸稳态机制（aminoacidhomeostaticmechanism)，氨基酸匮乏时通过激 活蛋白质分解途径将精氨酸释放到血液中参与循环，补充了精氨酸酶代谢造成的精氨酸耗 竭。
[0005] 精氨酸脱亚胺酶（argininedeiminase,EC3. 5. 3. 6，简称ADI)是一种极具潜力 的用于治疗精氨酸缺陷型肿瘤的抗癌新药。它能在细胞内将精氨酸分解成瓜氨酸和氨，使 精氨酸缺陷型癌细胞因精氨酸的供给被阻断而死亡，从而达到治疗癌症的目的。2002年， Ensor等发现在大肠杆菌中重组表达的支原体ADI对精氨酸营养缺陷型的23种人的黑素 瘤以及16种人的肝细胞瘤在体外和体内都具有活性，通过对ADI进行聚乙二醇（PEG)化 提高了ADI在体内的半衰期。2004年，他们将AD1-PEG-20用于肝癌的临床实验，结果成 功使患者血浆中的精氨酸的可检测浓度降为零。目前，美国凤凰公司开发的支原体来源的 ADI-PEG-20制剂用于肝细胞癌和黑素瘤（药品名称分别为H印acid和Melanocid)的II期 和III期临床试验正在全球多个中心进行。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种聚乙二醇共价修饰的精氨酸 脱亚胺酶（PEGadi)，该PEGadi免疫原性降低，活性下降少，半衰期延长。适合临床应用。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：
[0008] -种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，该化合物采用1~30个支化聚 乙二醇对精氨酸脱亚胺酶进行修饰，支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型甲氧基聚 乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，结构式如下：
【主权项】
1. 一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，其特征在于：该化合物采用1~ 30个支化聚乙二醇对精氨酸脱亚胺酶进行修饰，支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y 型甲氧基聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点，结构式如下：
所述的nl，n2，n3分别为大于等于1的正整数，且nl+n2+n3的值为80~2000,其中n3 的值优选为5~100 ;所述的R为修饰精氨酸脱亚胺酶的活性功能基团。
2. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，其特征在 于：Y型甲氧基聚乙二醇分子量为2000~lOOOODa。
3. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，其特征在 于：活性功能基团选自琥珀酰亚胺酯、硝基苯酯、琥珀酸基琥珀酸酯、琥珀酸基碳酸酯、马来 酰亚胺和碘代乙酰胺及其组合。
4. 根据权利要求3所述的一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，其特征在 于：活性功能基团选自琥珀酸碳酸酯。
5. 根据权利要求1~4任意一项权利要求所述的一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚 胺酶化合物，其特征在于：精氨酸脱亚胺酶采用3~12个Y型甲氧基聚乙二醇修饰。
6. 根据权利要求5所述的一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，其特征在 于：精氨酸脱亚胺酶采用5~9个Y型甲氧基聚乙二醇修饰。
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶。一种聚乙二醇修饰的重组精氨酸脱亚胺酶化合物，该化合物采用1～30个支化聚乙二醇对精氨酸脱亚胺酶进行修饰，支化聚乙二醇为含单一活性功能基团的Y型甲氧基聚乙二醇，并且单一活性功能基团设置在端点。本发明在同样降低免疫原性的情况下，修饰位点的个数更少，影响蛋白活性中心的可能性更低，因此蛋白酶比活性更高。本发明聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶比以往的精氨酸脱亚胺酶更有效地分解耗尽细胞的外源性精氨酸，更低的免疫原性，可用于治疗相关的多种肿瘤疾病。
【IPC分类】C12N9-96, C12N9-78
【公开号】CN104745565
【申请号】CN201510140645
【发明人】张弨, 封小燕, 张加慧, 刘翔, 韩雯
【申请人】杭州北斗生物技术有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月27日