一种碱性脂肪固定化碱性脂肪酶的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化碱性脂肪酶的制作方法。
【背景技术】
[0002]脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，可催化油脂的选择性水解及其它酯类的转酯、氨解反应等，是一种高效的生物催化剂，广泛应用于生物能源、食品、制革、洗涤、医药和有机合成等诸多工业领域。在众多脂肪酶中南极假丝酵母固定化脂肪酶B (以下简称固定化脂肪酶)的用途最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。
[0003]全球范围内，脂肪酶生产和销售呈每年扩张的趋势。脂肪酶的主要供应商丹麦诺维信的产能已经达到满产，而在丹麦，该产品的产能扩大受到成本的限制。国内的脂肪酶生产商缺乏提升产品品质的能力，一直处于低价格低质量的竞争状态，且没有产业化的固定化脂肪酶。
[0004]国际上适于生物柴油的脂肪酶产品主要有丹麦诺维信公司以及日本天野公司，其中诺维信公司生产的脂肪酶产品在整个酶法有机合成、药物合成以及生物柴油制备领域占垄断地位。据估计中国脂肪酶市场容量约为50亿元人民币，鉴于中国生物柴油、造纸、皮革、食品、饲料、医药制造行业的高速发展，脂肪酶的应用会越来越广泛，市场需求越来越大，预计在未来几年脂肪酶每年将以10%-15%的速度增长。
[0005]中国专利201310116628.3公开了一种制备固定化脂肪酶的方法。该方法，利用耦合固定化技术即吸附、交联及包埋三种结合的方法对脂肪酶进行固定化。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供了一种新的固定化碱性脂肪酶的制作方法。
[0007]本发明的技术方案是:
一种固定化碱性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步骤:
1)将固含量为420g/L的碱性脂肪酶发酵液3.St冷却至10°C，离心分离2h得到菌渣和液酶；
2)将液酶升温至30°C，加入磷酸盐至磷酸盐浓度为lmol/L，然后投入200kg载体，用氢氧化钾调节PH至6.0，搅拌24h，静置20h，离心分离得到固化酶和上清液；
3)向载体4倍体积的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氢氧化钾调节PH至7~8，搅拌1.5h，用空压在罐内压干甘氨酸，收集在罐内的固化酶；
4)将步骤3)得到的固化酶用2倍体积的lmol/L磷酸盐溶液搅拌洗涤并压干，重复5次，再用2倍体积的lmol/L磷酸盐溶液浸泡固化酶，搅拌30min，离心分离得到固化酶；
5)将步骤4)得到的固化酶投入到I倍体积的95%的乙醇中，搅拌处理lOmin，然后离心分离得到碱性脂肪酶；
6)将步骤5)得到的碱性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的环境下烘干1h得到固定化碱性脂肪酶成品。
[0008]进一步，所述磷酸盐为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
[0009]本发明在脂肪酶提取过程中不使用大量有机溶剂和其他有害原料，提高了固化酶活力，提高产品的使用批次达200或以上。
【具体实施方式】
[0010]下面通过具体实施例对本发明做进一步的描述。
[0011]实施例1
一种固定化碱性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步骤:
1)将固含量为420g/L的碱性脂肪酶发酵液3.St冷却至10°C，离心分离2h得到菌渣和液酶；
2)将液酶升温至30°C，加入磷酸二氢钾至磷酸二氢钾浓度为lmol/L，然后投入200kg载体，用氢氧化钾调节PH至6.0，搅拌24h，静置20h，离心分离得到固化酶和上清液；
3)向载体4倍体积的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氢氧化钾调节PH至7~8，搅拌1.5h，用空压在罐内压干甘氨酸，收集在罐内的固化酶；
4)将步骤3)得到的固化酶用2倍体积的lmol/L磷酸二氢钾溶液搅拌洗涤并压干，重复5次，再用2倍体积的lmol/L磷酸二氢钾溶液浸泡固化酶，搅拌30min，离心分离得到固化酶；
5)将步骤4)得到的固化酶投入到I倍体积的95%的乙醇中，搅拌处理lOmin，然后离心分离得到碱性脂肪酶；
6)将步骤5)得到的碱性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的环境下烘干1h得到固定化碱性脂肪酶成品。
[0012]经检验得到的固定化碱性脂肪酶活力为12100U/g。
[0013]实施例2
一种固定化碱性脂肪酶的制作方法，依次包括以下步骤:
1)将固含量为420g/L的碱性脂肪酶发酵液3.St冷却至10°C，离心分离2h得到菌渣和液酶；
2)将液酶升温至30°C，加入磷酸氢二钾至磷酸氢二钾浓度为lmol/L，然后投入200kg载体，用氢氧化钾调节PH至6.0，搅拌24h，静置20h，离心分离得到固化酶和上清液；
3)向载体4倍体积的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氢氧化钾调节PH至7~8，搅拌1.5h，用空压在罐内压干甘氨酸，收集在罐内的固化酶；
4)将步骤3)得到的固化酶用2倍体积的lmol/L磷酸氢二钾溶液搅拌洗涤并压干，重复5次，再用2倍体积的lmol/L磷酸氢二钾溶液浸泡固化酶，搅拌30min，离心分离得到固化酶；
5)将步骤4)得到的固化酶投入到I倍体积的95%的乙醇中，搅拌处理lOmin，然后离心分离得到碱性脂肪酶；
6)将步骤5)得到的碱性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的环境下烘干1h得到固定化碱性脂肪酶成品。
[0014]经检验得到的固定化碱性脂肪酶活力为12300U/g。
[0015]凡在不脱离本发明核心的情况下做出的简单的变形或修改均落入本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种固定化碱性脂肪酶的制作方法，其特征在于:依次包括以下步骤: 1)将固含量为420g/L的碱性脂肪酶发酵液3.St冷却至10°C，离心分离2h得到菌渣和液酶； 2)将液酶升温至30°C，加入磷酸盐至磷酸盐浓度为lmol/L，然后投入200kg载体，用氢氧化钾调节PH至6.0，搅拌24h，静置20h，离心分离得到固化酶和上清液； 3)向载体4倍体积的上清液中加入15.17kg甘氨酸，待甘氨酸全部溶解后，投入固化酶，用氢氧化钾调节PH至7~8，搅拌1.5h，用空压在罐内压干甘氨酸，收集在罐内的固化酶； 4)将步骤3)得到的固化酶用2倍体积的lmol/L磷酸盐溶液搅拌洗涤并压干，重复5次，再用2倍体积的lmol/L磷酸盐溶液浸泡固化酶，搅拌30min，离心分离得到固化酶； 5)将步骤4)得到的固化酶投入到I倍体积的95%的乙醇中，搅拌处理lOmin，然后离心分离得到碱性脂肪酶； 6)将步骤5)得到的碱性脂肪酶固化酶在40°C、真空度-0.09MPa的环境下烘干1h得到固定化碱性脂肪酶成品。
2.根据权利要求1所述的所述的固定化碱性脂肪酶的制作方法，其特征在于:磷酸盐为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化碱性脂肪酶的制作方法，1）提取液酶；2）固化；3）甘氨酸处理；4）将步骤3）得到的固化酶用2倍体积的1mol/L磷酸盐溶液搅拌洗涤并压干，重复5次，再用2倍体积的1mol/L磷酸盐溶液浸泡固化酶，搅拌30min，离心分离得到固化酶；5）将步骤4）得到的固化酶投入到1倍体积的95%的乙醇中，搅拌处理10min，然后离心分离得到碱性脂肪酶；6）将步骤5）得到的碱性脂肪酶固化酶在40℃、真空度-0.09MPa的环境下烘干10h得到固定化碱性脂肪酶成品。本发明在脂肪酶提取过程中不使用大量有机溶剂和其他有害原料，提高了固化酶活，提高产品的使用批次达200或以上。
【IPC分类】C12N11-00
【公开号】CN104762287
【申请号】CN201510199817
【发明人】林楠棋, 詹艳艳, 张书汁, 张欣
【申请人】焦作健康元生物制品有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月25日