一种水稻来源的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI3及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自 水稻（Oryza sativa)的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI3的分离和克隆及应用。
【背景技术】
[0002] 转基因技术为研宄植物功能及分子育种等方面带来了巨大的便利，目前用于转基 因植物研宄的标记基因有几十种，其中筛选标记基因常用来鉴定植株的转化体，如抗除草 剂基因和抗潮霉素基因等。
[0003] 在植物遗传转化中，常利用标记基因筛选含有目的基因的转化体，并使其完整再 生，经分化获得遗传性状改良的转化植株。
[0004] 筛选标记基因的潜在安全风险是目前公众对转基因技术担忧的一个重要方面。现 有转基因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基 因一起转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植 株。标记基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道，存在与肠道微生物 基因交换产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基 因，其他类型筛选标记基因被陆续研宄开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可 视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模 化应用。
[0005] 为避免对抗生素等传统筛选剂的依赖，降低抗生素抗性基因等筛选标记的潜在风 险，近年来一些安全性更好的筛选标记基因应用于转基因作物的研发，并取得了很好的效 果。如磷酸甘露糖异构酶（phosphate mannose isomerase，PMI)基因是一种糖代谢基因， 水稻等许多高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸 甘露糖异构酶，或者表达量很低，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进 入糖酵解途径而被利用。因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。而且与抗生素、 除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用 甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率较高。甘露糖广泛存在于海藻、蕨类等植物中，同时PMI 的催化产物6-磷酸果糖是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。因此 PMI基因是一种安全筛选标记，有效避免了抗生素、除草剂等抗性基因存在的潜在风险。目 前，PMI筛选标记基因已在水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物中得到成功应用，在开发安全性 较好的转基因作物及其产品方面，具有广泛的应用前景。
[0006] 但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，这是 因为目前人们还没有意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转 化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧，或者是人们对这种从原核生 物大肠杆菌中分离出的PMI的安全性没有引起足够的重视。因此，本领域有对安全性更好 的高等植物源PMI筛选标记基因的迫切需求，但目前还没有高等植物源的PMI筛选标记基 因的报道。
【发明内容】
[0007] 针对目前使用的PMI筛选标记来自大肠杆菌这一现状，本申请的发明人基于在转 基因领域多年的研宄经验，意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能 对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。并且考虑到高度植物源 PMI筛选标记基因研宄较少的问题，本发明希望获得高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基 因，并以其为安全的筛选标记基因进行植物遗传转化。更具体而言，本申请的发明人从水稻 (Oryza sativa)中分离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI3。另外，本发明还构建了含 有0sPMI3的原核表达载体，应用于0sPMI3蛋白的酶活分析；构建了含有0sPMI3的植物表 达载体，并以其作为筛选标记，应用于植物遗传转化。
[0008] 为了解决这个问题，本申请的发明人针对可能含有磷酸甘露糖异构酶基因的不同 植物，进行了大量植物提取实验和酶活分析，并最终从水稻中成功分离、克隆了磷酸甘露糖 异构酶基因0SPMI3,并以其作为筛选标记基因，成功获得了转基因植物。
[0009] 具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基 因，所述磷酸甘露糖异构酶基因0SPMI3提取自高等植物，优选提取自水稻。
[0010] 进一步地，所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI3的核苷酸序列为下列之一：
[0011] (a)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0012] (b)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或 者
[0013] (c)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核 苷酸序列；或者
[0014] (d)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列；或者
[0015] (e)与带有SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的 对应核苷酸序列，
[0016] 优选地，所述磷酸甘露糖异构酶基因0SPMI3的核苷酸序列SEQ ID NO: 1中所示的 核苷酸序列，其中，SEQ ID NO: 1中的序列为：
[0017]
【主权项】
1. 一种磷酸甘露糖异构酶基因0SPMI3,其特征在于，所述磷酸甘露糖异构酶基因 OsPMI3分离克隆自高等植物。
2. 根据权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因 OsPMI3,其特征在于，所述磷酸甘露 糖异构酶基因0sPMI3的核苷酸序列为下列之一： (a) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列；或者 (b) 与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列；或者 (c) 在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸 序列；或者 (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列； 或者 (e) 与带有SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列的植物杂交后所获得的相应产物的对应 核苷酸序列， 优选地，所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI3的核苷酸序列SEQ ID NO: 1中所示的核苷 酸序列，其中，SEQ ID NO: 1中的序列为：
3. -种原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体包含权利要求1或2所述的磷酸 甘露糖异构酶基因0sPMI3。
4. 一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶 基因 OsPMI 3。
5. -种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包含权利要求1或2所述的磷酸 甘露糖异构酶基因0sPMI3和/或权利要求4所述的表达盒。
6. -种获得植物转化细胞的方法，包括下述步骤： (1) 分离植物种子的胚，并置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织； (2) 将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得能够用于 转化的愈伤组织； (3) 利用所述的磷酸甘露糖异构酶基因 OsPMI3制备植物表达载体 pCAMBIA1381-〇sPMI3,其中，pCAMBIA1381 为现有植物载体； (4) 将所述植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI3转入根癌农杆菌中，并将步骤（2)中获 得的愈伤组织与根癌农杆菌接触第一预定时间； (5) 将步骤（4)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，在预定温度 下培养第二预定时间； (6) 将步骤（5)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养第三预定时间； (7) 将步骤（6)处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所述筛 选培养基中包含甘露糖，所述抗性愈伤组织为能够代谢甘露糖的植物转化细胞。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻，所述植物转化细胞为水 稻转化细胞。
8. -种获得转基因植物或植物部分的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求 6所述的方法获得植物转化细胞，并利用所获得的植物转化细胞培育转基因植物或植物部 分。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花丼 作物、能源作物。
10. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细 胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和 种子。
【专利摘要】本发明提供了一种植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI3，该磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI3的核苷酸序列为在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个核苷酸后所获得的核苷酸序列。本发明还提供一种含有OsPMI3的原核表达载体。本发明还提供一种磷酸甘露糖异构酶的酶活分析方法。本发明利用OsPMI3基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。本发明成功分离和克隆出植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，由于该磷酸甘露糖异构酶基因来源于植物(水稻)，对人类没有潜在危险。可以用于替代来自大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶，从而降低潜在的安全风险。
【IPC分类】C12N15-84, C12N15-70, C12N15-61, A01H5-00
【公开号】CN104762308
【申请号】CN201510161832
【发明人】李 浩, 杨剑波, 魏鹏程, 李娟 , 李莉, 杨亚春, 许蓉芳, 秦瑞英, 胡磊, 马卉
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月7日