人凝血因子viii基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突 变的原位修复质粒、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 血友病A (Hemophilia A，HA)是最常见的X连锁出血性遗传病，发病率较高，重型 血友病具有致残致死性，尚无根治方法。HA-直被学术界认为是最有可能通过基因治疗治 愈的遗传病之一，其病因是由于人凝血因子VIII基因（以下简称F8)缺陷而导致人凝血 因子VIII蛋白（FVIII)含量不足或功能缺陷，从而引起凝血功能障碍，在出生男婴中的发 病率约为1/5000。HA的主要症状为自发性出血或创伤后出血不止。关节反复出血常可致 残，重型血友病（FVIIK1%，约占血友病患者的50% -60% )患者甚至可能由于颅内出血 而危及生命。目前针对该病主要使用含FVIII的血浆制品行替代治疗，早期的血浆制品存 在病毒污染（艾滋病病毒、丙型肝炎病毒等）等问题，工艺改进后以及重组的FVIII制品价 格昂贵，由于FVIII在血浆中的半衰期只有12小时，因此血友病患者常需终身反复输注，这 给患者及家庭带来了沉重的经济及心理负担。另外，一部分HA患者会由于反复输注而产生 FVIII抑制性抗体，导致替代治疗无效。
[0003] 基因治疗作为一种全新的治疗方式，为类似血友病这样的严重单基因遗传病带来 了新的希望。而血友病也一直被学术界认为是最有可能实现基因治疗的遗传病之一。基因 治疗最理想的方式是原位修复，即在缺陷基因的原位点通过同源重组的途径进行精确的基 因修复。这样修复的好处是显而易见的：不仅保留了基因的完整性，同时还保留了基因的 调控元件，修复后的基因能够像正常人的一样发挥作用，但是该方法对技术要求较高。另一 种基因治疗方式是基因替代，就是将带有启动子的治疗基因随机或者定点整合到缺陷细胞 中，从而达到治疗的目的。由于技术的限制，目前进行的绝大部分基因治疗研宄都是采用基 因替代策略。
[0004] F8于1984年被成功克隆，该基因长达186kb，包含26个外显子，是已克隆的最大 基因之一。其cDNA长达9kb，这对目前的载体系统是一个比较大的挑战。即使是采用广泛使 用的B区缺失策略，编码序列也有约4. 5kb，这直接导致使用常规的基因治疗手段，很难达 到较高的治疗基因整合效率。这是导致目前HA的基因治疗研宄未取得突破的一个原因。 血友病B (hemophilia B，HB)的发病率只有HA的约四分之一，但是目前已有较有效的针对 HB的基因治疗研宄，一定程度上是因为人凝血因子IX基因（F9)的编码序列只有1.4kb，比 较易于操作。
[0005] F8的突变类型非常多，至今人类突变数据库（The Human Gene Mutation Database，HGMD)记录的突变种类已有2800多种，包括错义突变、无义突变、小片段缺失与 插入等。Lakich等在1993年发现，约有45%的重型患者为22号内含子倒位型突变。机制 如图1所示，F8的22号内含子内部含有两个转录的基因，A基因和B基因。在F8基因外 部，位于X染色体的远端还有两个与A基因高度同源的拷贝。在男性减数分裂过程中，F8 基因内的A基因可能与F8外的任何一个A基因配对，从而导致同源重组介导的倒位发生， 中间倒位的片段长达〇. 6Mb，直接导致F8基因被完全破坏，进而导致患者呈现重型HA的表 型。
[0006]从图1我们可以发现，该倒位对F8的直接结果是导致22号内含子以后的部分与 前一部分完全分开。另外虽然牵涉了大片段的倒位，但是F8前22个外显子以及启动子区 域是完全保留的，而通过比对我们发现后面4个外显子的编码序列仅有627bp。
[0007]人体中FVIII由肝脏分泌，主要是肝血窦内皮细胞（endothelial cells，ECs)。这 类细胞由于取材难度以及增殖能力的限制，并不适合直接用来进行基因打靶。而人诱导多 潜能干细胞由于具有无限增殖能力以及多向分化潜能，非常适合用于验证这种修复策略。 最近国际上在iPSCs诱导方面取得了一些突破性进展，比如北京大学的邓宏魁实验室建立 了仅使用小分子化合物成功诱导出了小鼠iPSCs。这种技术完全避免了病毒感染和其它转 基因诱导的使用，大大地提高了 iPSCs的安全性。虽然这些前沿性技术现在还仅仅在小鼠 细胞实现，但是纵观干细胞的发展史，我们有理由相信在不久的将来很有可能会出现相对 安全的人iPSCs诱导技术，届时iPSCs在再生医学以及基因治疗领域的应用将翻开新的篇 早。
[0008] 进两年兴起的类转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)TALENs是一种人工核酸酶，与上一代人工核酸酶锌指酶 (zinc finger nucleases，ZFNs)相比，具有易于设计以及较高的有效率等特点。TALENs与 ZFNs类似，可以特异性切割DNA产生双链断裂（double strand break，DSB)。由于细胞修 复DSB主要是通过不精确的非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ)机制修 复，所以目前TALEN被广泛用来做基因敲除。另一方面，DSB可以激活位点附近的同源重组 (homologous recombination)活性，在打祀载体存在的情况下，可提高基因打革E效率达3 个数量级之多。
[0009]目前针对血友病的基因治疗研宄都是采用基因替代的方法，就是将一个完整的外 源人凝血因子VIII基因（F8基因）表达框导入到缺陷细胞内，从而发挥作用替代缺陷的基 因，而缺陷的基因本身并没有得到修复。针对突变基因最理想的策略是原位修复，HA当中 最常见的突变类型是22号内含子倒位型突变，约有45%的重度HA患者的都这种突变类型， 开发一种针对这种突变的原位修复方法对疾病的研宄是很有意义的。目前在其他基因的原 位修复研宄中，一般是针对点突变的修复，还没有针对F8基因22号内含子倒位突变的原位 修复策略。
[0010] 如上所述，目前还没有针对22号内含子倒位型F8突变的原位修复策略。如果把 范围扩大的话，目前HA的基因治疗研宄倒是有不少，都是使用的随机整合策略。这种策略 是一种比较粗放的基因治疗方式，就是使用一个质粒来转染F8缺陷的细胞，这个质粒包含 了 F8的整个编码序列以及一个启动子序列。F8表达框有一定几率整合到基因组中，从而表 达FVIII蛋白发挥作用。其缺点有：
[0011] a. F8很大，编码序列为8kb左右，即使是一种B区缺失的版本也有4k多，再加上启 动子序列，那么这个质粒很大，一般来说质粒越大，构建也越麻烦，整合效率也很低。
[0012] 而我们的策略最终整合的片段只有627bp的编码序列和一个polyA信号，总长为 893bp，技术上非常容易实现；
[0013] b.如果基因随机整合到基因组中，基因的表达可能会受到位置效应的影响，有可 能表达效率低，甚至不能表达。
[0014] 我们的策略是原位修复，就是将原来的突变的基因修复，这样可以在基因原有的 启动子以及调控元件下，像正常人的那样表达；
[0015] c.如果质粒整合到其他内源性基因则有可能破坏内源性基因或者激活原来不表 达的有害基因，从而导致不好的后果。
【发明内容】
[0016] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒 位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法。
[0017] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0018] 本发明提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质 粒，所述质粒序列如SEQ ID N0. 29所示，命名为质粒F8-22-PGK-Neo。
[0019] 本发明还提供了一种构建上述质粒的试剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO. 7至SEQ ID NO. 18所示的引物。
[0020] 本发明还提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试 剂盒，所述试剂盒包括序列如SEQ ID NO. 1至SEQ ID N0. 28所示的引物。所述试剂盒中还 包括质粒 F8-22-PGK-Neo。
[0021] 本发明还提供了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复方 法，所述方法是采用人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试剂盒将人 凝血因子VIII基因23-26号外显子的编码序列及polyA信号通过同源重组的方式添加到 人凝血因子VIII基因22号外显子和22号内含子的交界处，将22号内含子倒位型突变的 人凝血因子VIII基因遗传信息补全。具体包括如下步骤：
[0022] (1)构建TALENs表达质粒；
[0023] (2)构建质粒 F8-22-PGK_Neo;
[0024] (3)用TALENs表达质粒和质粒F8-22-PGK-Neo转染人凝血因子VIII基因22号内 含子倒位型突变的人诱导多潜能干细胞中进行原位修复。
[0025] 下面对本发明作进一步说明：
[0026] 本发明试剂盒所涉及的引物如表1所示：
[0027]表1
[0028]
【主权项】
1. 一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒，其特征在于，所 述质粒序列如SEQIDNO. 29所示，命名为质粒F8-22-PGK-Neo。
2. 构建权利要求1所述质粒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括序列如SEQID NO. 7至SEQIDNO. 18所示的引物。
3. -种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复试剂盒，其特征在于， 所述试剂盒包括序列如SEQIDNO. 1至SEQIDNO. 28所示的引物。
4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括权利要求1所述的质 粒。
5. -种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复方法，其特征在于，所 述方法是采用权利要求3所述的试剂盒将人凝血因子VIII基因23-26号外显子的编码序 列及PolyA信号通过同源重组的方式添加到人凝血因子VIII基因22号外显子和22号内 含子的交界处，将22号内含子倒位型突变的人凝血因子VIII基因遗传信息补全。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用权利要求3所述的试剂盒将人凝血 因子VIII基因23-26号外显子的编码序列及polyA信号通过同源重组的方式添加到人凝 血因子VIII基因22号外显子和22号内含子的交界处包括如下步骤： (1) 构建TALENs表达质粒； (2) 构建质粒F8-M-PGK-Neo; (3) 用TALENs表达质粒和质粒F8-22-PGK-Neo转染人凝血因子VIII基因22号内含子 倒位型突变的人诱导多潜能干细胞中进行原位修复。
【专利摘要】本发明公开了一种人凝血因子VIII基因22号内含子倒位型突变的原位修复质粒、试剂盒及方法。本发明构建了针对性的原位修复治疗，针对性地修复这种类型的F8突变，并且联合应用TALEN技术在血友病病人特异的iPSCs中验证了这种原位修复策略。这是国际上第一个针对内含子22倒位这种常见HA突变的原位修复策略。原位修复策略导入的序列是精确的定点导入，相对安全，不存在现有技术中的不确定性。
【IPC分类】C12N15-55, C12N15-12, C12N15-85
【公开号】CN104762318
【申请号】CN201510053175
【发明人】梁德生, 吴涌, 邬玲仟
【申请人】中南大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年2月2日