实时荧光pcr检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的 方法及其试剂盒、引物和探针。
【背景技术】
[0002] 传染性软化病病毒属细小核糖核酸病毒科（Picornaviridae)，是线性单链RNA病 毒，是造成家蚕软化病的病原物，也是造成世界蚕业经济损失的一大元凶。由于对上述蚕病 缺少有效的控制手段，因此早期的对病原微生物的检测鉴定非常重要，准确灵敏的检测方 法能有效的防止疾病的传播，减少经济损失。
[0003] 显微镜被广泛用于家蚕病原微生物的检测，但由于传染性软化病病毒所引起的病 症和某些其他病毒及细菌引起的病症相似，因此用普通光学显微镜较难确诊。即便确诊，受 显微镜法特异性和灵敏度的限制，也很难实现早期诊断。血清学鉴别法具有特异性强、灵敏 度高的特点，但是存在比较高的交叉反应与非特异性反应。随着分子生物技术的发展，传染 性软化病病毒可通过在保守区域设计特异性引物，将病毒RNA反转录成cDNA后，进行PCR 检测。实时荧光PCR (Real-time PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒 )的引物和探针，本发明的第二个目的是提供采用上述的引 物和探针的检测试剂盒，本发明的第三个目的是一种实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病 病毒的方法。本发明实现在家蚕中对上述病原微生物的快速早期诊断。
[0005] 为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案： 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒（) 的引物和探针，上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述 的探针为 FAM- ITGAGGAGAACGCCAAGGAA -Eclipse。
[0006] 为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案： 一种用于实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的试剂盒，该试剂盒包括引物和探 针，上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT， 下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的探针为？八11_ TTGAGGAGAACGCCAAGGAA -Eclipse。
[0007] 为了实现上述第三个目的，本发明采用以下技术方案： 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法，该方法包括以下的步骤： 1)样本RNA提取及cDNA的合成 选取感染上述微生物的家蚕幼虫，以中肠为提取RNA的对象；取0. 2g上述样品，在液氮 中充分研磨后，使用RNA抽提试剂盒UNIQ-10进行RNA抽提，抽提后的RNA用DNasel处理； 取适量的RNA，利用反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，cDNA稀释5倍后可用于Real-time PCR检测； 2) 实时荧光PCR扩增检测 上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的 探针为 FAM- ITGAGGAGAACGCCMGGAA -Eclipse;实时荧光 PCR 反应体系如下：10ul Premix Ex Taq，上游引物0. 4ul，浓度为10 pmol/yl，下游引物0. 4ul，浓度为10 pmol/yl，探针 0. 4ul，浓度为10 pmol/yl，取上述稀释后的cDNA液lul，用水补足体积至20ul。应用荧 光定量 PCR 仪 lightcycle 480 进行反应，反应程序为（1) 95°C，10 sec;(2) 95°C，5 sec; 60°C，23 sec ;40 个循环； 3) 结果判定 Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。
[0008] 本发明由于采用了上述的技术方案，提供了一种利用Real-time PCR技术对家蚕 传染性软化病病毒进行检测的方法。由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了 早期检测的检出率，并简化了检测方法。本发明能提高家蚕中上述病原物的早期检测的检 出率，可有效的防止疾病的传播，减少经济损失。
【具体实施方式】
[0009] 实施例1:引物和探针的设计 基于家蚕传染性软化病病毒RNA序列（HM245295. 1，HM569717. 1，EU868609. 1， EF422866. 1，AB000906. 1 (基因序列号)），用生物信息学方法根据引物设计原则，并利用 Primer Express设计软件设计了符合"印度株"、"日本株"和"浙江株"各自特异性的引物 和荧光探针各一组。利用DNAStar软件，将上述两组引物和探针进行序列比对，设计了可 同时检测上述三种株系的通用引物和探针一对(表1)。将设计得到的引物和探针一一进行 BLAST验证（http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/)，验证结果显示，不论引物或探针，与之完 全匹配的碱基序列都显示为"传染性软化病病毒"序列，保证了引物探针的高特异性。
[0010] 表1家蚕微粒子、核型多角体病毒和浓核病毒检测的引物和探针
【主权项】
1?实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒Kirw1S)的引 物和探针，其特征在于：上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述 的探针为FAM-ITGAGGAGAACGCCAAGGAA-Eclipse。
2. -种用于实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的试剂盒，其特征在于该试 剂盒包括引物和探针，上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为 AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述 的探针为FAM-ITGAGGAGAACGCCAAGGAA-Eclipse。
3. 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法，其特征在于该方法包括以下的步 骤： 1) 样本RNA提取及cDNA的合成 选取感染上述微生物的家蚕幼虫，以中肠为提取RNA的对象；取0. 2g上述样品，在液氮 中充分研磨后，使用RNA抽提试剂盒UNIQ-10进行RNA抽提，抽提后的RNA用DNaseI处理； 取适量的RNA，利用反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，cDNA稀释5倍后可用于Real-time PCR检测； 2) 实时荧光PCR扩增检测 引物探针序列采用权利要求1所述的引物和探针，实时荧光PCR反应体系如下：10ul PremixExTaq，上游引物0.4ul，浓度为10pmol/yl，下游引物0.4ul，浓度为10pmol/ y1，探针0. 4ul，浓度为10pmol/y1，取上述稀释后的cDNA液lul，用水补足体积至20ul， 应用荧光定量PCR仪Iightcycle480进行反应，反应程序为（I) 95°C，10sec;(2) 95°C， 5sec;6CTC，23sec;40 个循环； 3) 结果判定 Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，尤其涉及实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针。上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的探针为FAM- TTGAGGAGAACGCCAAGGAA –Eclipse。本发明由于引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，提高了早期检测的检出率，并简化了检测方法。本发明能提高家蚕中上述病原物的早期检测的检出率，可有效的防止疾病的传播，减少经济损失。
【IPC分类】C12N15-11, C12R1-93, C12Q1-70, C12Q1-68
【公开号】CN104762415
【申请号】CN201510120660
【发明人】吴姗, 董强, 鲁兴萌, 朱青青, 张瑾
【申请人】浙江省检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月19日