一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明设及一株能稳定高表达Neuritin 截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 各种神经损伤和神经系统退行性病变（如老年痴呆、帕金森病等）一直是困扰人 类的一大疾患，且该类疾患呈现出高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率等特点，给社会和 家庭带来了沉重的负担。治疗各类神经系统疾病和神经损伤的关键是提高受损神经的修复 能力，众多的实验表明，各类神经营养因子可W为神经再生提供良好的微环境，在防止神经 细胞的退变和促进神经突起的生长方面均起着十分重要的作用。
[0003] Neuritin(CPG15,NRN1)是近年发现的神经营养因子，在神经突触可塑性、保护 受损神经元和促进神经再生过程中有重要的作用。因此，获取高纯度且具有天然活性的 Neuritin蛋白对治疗各种神经退行性疾病如老年痴呆症、阿尔茨海默病等有着良好的应用 前景。利用基因工程技术制备大量Neuritin重组蛋白，是生物学功能研究和临床需要的基 础。
[0004] 当代医学对神经系统疾病和神经损伤还缺少有效的治疗和/或预防的药物。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一株能稳定高表 达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株--己斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，所述己斯德毕赤酵母GS115-pPI C9K-neuritin-l-20110415,其保藏编号为CGMCCNO;9912。
[000引本发明的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株命名为己斯德毕赤酵 母GS115-pPIC9K-neuritin-l-20110415,其于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中屯、（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所），保藏编号为CGMCCNO;9912。
[0009] 在其中一些实施例中，所述Neuritin截短体蛋白为缺少信号肤和GPI错定位点的 可溶性蛋白。
[0010] 本发明还提供了上述高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的应用。
[0011] 在其中一些实施例中，所述应用为所述重组菌株表达的Neuritin截短体蛋白在 促进坐骨神经损伤后再生修复的药物制备中的应用。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0013] 本发明提供了一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，并 对其表达的蛋白制定了活性单位。与目前市场上所售的大肠杆菌表达的Neuritin截短体 蛋白相比，真核细胞表达的外源蛋白具有翻译后修饰的生物活性，且外源基因稳定整合于 酵母染色体内，能稳定传代且易于规模化培养等优点。通过动物实验发现；Neuritin能够 促进损伤后早期坐骨神经的再生和功能恢复，为外周神经损伤的治疗提供了一个新的方 法，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中的SDS-PAGE筛选高表达菌株表达Neuritin蛋白的图 谱；
[0015] 图2为本发明实施例2中的SDS-PA(iE分析纯化的融合蛋白的图谱；
[0016] 图3为本发明实施例3中western-blot鉴定Neuritin与His标签结果；
[0017] 图4为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对PC12细胞的作用，其中A为阴 性对照任85)巧为阴性对照组化><化3,20^肖/1111);(：为实验组（爬脚1^11，20^肖/1111); [001引图5为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对鸡胚背根神经节细胞的作用； 其中A为空白对照组（10X)，B为阴性对照组化X化s，20yg/ml，10X)，C为阴性对照组 炬SA，20yg/ml, 10X)，D为实验组（Neuritin, 24yg/ml，10X);
[0019] 图6为实施例4的不同时间段各组实验大鼠SFI恢复趋势图；
[0020] 图7为实施例4的不同时间段各组实验大鼠NCV恢复率比较结果图；
[0021] 图8为实施例4的不同时间段各组实验大鼠肌张力的结果图；
[0022] 图9为实施例4在第4周各实验组的神经肥染色的结果图（200X)，其中；A为生 理盐水组，B为Neuritin5yg组；
[002引图10为实施例4在第4周不同实验组的神经髓銷染色的结果图（400X);其中；A为生理盐水组，B为Neuritin5yg组；
[0024] 图11为实施例4的不同时间各实验组有髓神经纤维通过率比较的结果图；
[0025] 图12为实施例4在第4周神经纤维锻银染色的结果图（200X);其中；A为生理盐 水组，B为Neuritin5yg组；
[0026] 图13为实施例4在第4周的免疫组化检测GAP43的结果图；其中；A为生理盐水 组，B为Neuritin5yg组；
[0027] 图14为实施例4在第4周的免疫组化检测NF200的结果图；其中；A为生理盐水 组，B为Neuritin5yg组。
【具体实施方式】
[002引为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0029] W下实施例中所使用的试剂均来源于市售。
[0030] 如无特殊说明，W下实施例中的实验方法，均为常规方法。
[0031] 实施例1高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的筛选
[0032]本实施例中的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的筛选步骤如 下：
[00扣]1、构律電紀毕赤酵母
[0034] 按照中国发明专利CN200810227347-"Neuritin截短体蛋白活性片段及其表达系 统和专用载体"中实施例1的方法，Wneuritin截短体为模板，扩增neuritin截短体片段， PCR产物用EcoRI、NotI限制性内切酶酶切、纯化后进行酶切产物的连接，转染D册a感 受态细胞，挑取PCR鉴定为阳性的阳性转化子与毕赤酵母GS115感受态细胞电转化，将菌液 涂布在MD板上，30°C培养至菌落出现，即为重组毕赤酵母；
[0035] 2、筛洗_高表达Neuritin截短体軍白的毕赤酵母電紀.商株
[0036] 将MD板上的单菌落分别接种至200y1YPD培养液的96孔板，30°C培养2d。然后 取新的96孔板，每孔加入190y1YPD，吸取10y1第一批96孔板中培养的菌液加入到新板 中，各孔一一对应，30°C培养过夜。再取新的96孔板，每孔仍加入190ylYPD，吸取lOul第 二批96孔板中培养的菌液加入到新板中，各孔一一对应，30°C培养过夜。从第=批96孔板 中各吸取 10y1 菌液加到含有 0. 25,0. 5,1. 0,1. 5, 2. 0, 3. 0,4.Omg/mlG418 的YPD板上，并 编号。30°C培养2-5山至菌落出现。挑取筛选后的单菌落于lOyl无菌水中，煮沸lOmin， 将菌液置-80°C冰箱lOmin，再煮沸lOmin，离屯、后取上清液作为模板作PCR检测，体系如 下：
[0037]
【主权项】
1. 一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，其特征在于，所述重组菌株 为巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-l-20110415,其保藏编号为CGMCCNO:9912。
2. 根据权利要求1所述的高表达的Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，其特征 在于，所述Neuritin截短体蛋白为缺少信号肽和GPI锚定位点的可溶性蛋白。
3. 权利要求1或2所述的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为所述重组菌株表达的 Neuritin截短体蛋白在促进坐骨神经损伤后再生修复药物制备中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用，所述重组菌株为巴斯德毕赤酵母，其保藏编号为CGMCC NO：9912。本发明提供了一株毕赤酵母重组菌株表达的Neuritin截短体蛋白与目前市场上所售的大肠杆菌表达的Neuritin截短体蛋白相比，真核细胞表达的外源蛋白具有翻译后修饰的生物活性，且外源基因稳定整合于酵母染色体内，能稳定传代且易于规模化培养等优点。适当浓度的Neuritin能够促进损伤后早期坐骨神经的再生和功能恢复，为外周神经损伤的治疗提供了一个新的方法，具有良好的应用前景。CGMCC No.991220141031
【IPC分类】C12R1-84, A61K38-18, C12N1-19, A61P25-02
【公开号】CN104774777
【申请号】CN201510014771
【发明人】黄瑾, 杨磊, 朱井玲, 张云华, 崔丽娟, 单莉娅
【申请人】石河子大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年1月12日