一种具有抗菌活性的多肽Pt5e的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程药物技术领域。设及一种具有中和内毒素作用的高磯蛋白衍 生多肤。其技术设及基因定点突变、重组表达、分离纯化、重组多肤的抗菌功能、中和内毒素 功能W及细胞毒性分析技术。重组多肤在浓度1.2和1.8 时，可W完全抑制大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌生长。重组多肤Pt5e能抑制炎症因子TNF-a释放，结合并中和内毒素， 保护内毒素血症小鼠，保护率达60%W上，且无细胞毒性、无溶血副作用。
【背景技术】
[0002] 败血症是一种血液中毒病症，主要是由身体某些部位感染的细菌扩散至血液，细 菌在血液中大量繁殖，产生内毒素（Lipoplysaccharide，LP巧，细菌内毒素主要通过两个方 面发生作用；一方面为LI^S在细菌周围形成一层保护屏障W逃避抗生素的作用；另一方面 LI^S作用于宿主细胞，诱导诸如TNF、IL等细胞因子的释放，从而使机体处于混乱状态，导致 过度炎症，严重时引起人体多种器官功能受损、可导致脈毒性休克，使病人衰竭，最终死亡。 即使在美国该样医疗水平高度发达的国家，每年仍有超过200, 000人死于败血症。因此，败 血症是常见而又严重的临床疾病，对患者生命威胁、危害极大。
[0003] 败血症的治疗最主要在于阻断、遏制和消除内毒素作用。目前，治疗败血症主要依 靠抗生素结合其他辅助方法来实现。迄今，临床上还缺乏一种可W特异性中和内毒素而没 有副作用的药物。即使新近生产的抗内毒素抗体和血液净化方法等，临床上疗效也不甚明 显〇
[0004] 抗菌肤由于具有广谱抗菌活性和结合内毒素、阻止炎症因子释放等抗菌作用，W 及对正常细胞无损伤等作用。近年来已经成为理想的治疗败血症候选药物。例如，抗菌 肤化-37不但可W结合并中和内毒素，而且具有治疗败血症作用，能明显提高成活率。但 是，化-37具有溶血副作用，极大地限制了其在临床上的应用。但不容忽视的是抗菌肤已 成为未来对抗内毒素的主要研究对象。我们发现，通过定点突变、重组表达的高磯蛋白 (地osvitin)衍生抗菌多肤Pt5e，不但具有广谱抗菌作用、可W结合内毒素，而且能够抑制 炎症因子释放、显著提高内毒素血症小鼠成活率，而无细胞毒性和溶血作用发生，因此是一 种具有良好前景的治疗败血症的药物。
【发明内容】
[0005] 本发明是发现了一种可用于治疗败血症的新型抗菌肤Pt5e，及其设计和制备技 术。抗菌肤原始序列来源高磯蛋白基因，我们采用定点突变和重组表达制备高磯蛋白衍生 抗菌多肤Pt5e，并中和内毒素功能W及细胞毒性分析，验证了Pt5e应用于败血症治疗的可 行性。
[0006] 本发明更详细的实施方法可参见实施例。
【附图说明】
[0007]图1;高磯蛋白与其C-端55个氨基酸组成多肤Pt5。示由P巧经定点突变，获得 重组表达突变体流程。
[000引图2 ;重组表达多肤电泳（A)和免疫印迹炬）。M，标准蛋白；Lane1，重组表达 多肤Pt5;Lane2，重组表达多肤Pt5a;Lane3，重组表达多肤P巧b;Lane4，重组表达 多肤Pt5c;Lane5，重组表达多肤Pt5d;Lane6，重组表达多肤Pt5e;Lane7，重组表达 多肤Pt5f。
[0009] 图3;透射电镜结果。示PBS(A、C)或者Pt5e炬、D)与公.。〇"^及5： 在25°C共育1小时对细菌的影响。
【具体实施方式】
[0010] (1)定点突变W及重组蛋白表达与纯化 基于P巧序列，设计特定的系列引物制作6个突变体Pt5a、P巧b、Pt5c、P巧tPt5e和P巧f。采用定点突变获得高磯蛋白衍生多肤Pt5e，构建表达载体导入大肠杆菌诱导表达，突 变体在C(97i，经亲和层析纯化，得电泳纯多肤。
[0011] 多肤Pt5、Pt5a、P巧b、Pt5c、P巧d、Pt5e和Pt5f的DNAW及氨基酸序列见序列表， 其中P巧的核巧酸和氨基酸序列标识符为1 ;P巧的纯氨基酸序列标识符为2 ;P巧a的核 巧酸和氨基酸序列标识符为3 ;P巧a的纯氨基酸序列标识符为4 ;P巧b的核巧酸和氨基酸 序列标识符为5 ;P巧b的纯氨基酸序列标识符为6 ;P巧C的核巧酸和氨基酸序列标识符为 7 ;P巧C的纯氨基酸序列标识符为8 ;P巧d的核巧酸和氨基酸序列标识符为9 ;P巧d的纯氨 基酸序列标识符为10 ;P巧e的核巧酸和氨基酸序列标识符为11 ;P巧e的纯氨基酸序列标 识符为12 ;P巧f的核巧酸和氨基酸序列标识符为13 ;P巧f的纯氨基酸序列标识符为14。
[0012] (2)重组多肤具有广谱抗菌作用 先导实验采用微量稀释分析法（microdilutionassay)分析6个重组多肤抗菌活性， 发现其中Pt5e抗公.co7i和5： 饼W活性最强，最小抑菌浓度分别为1. 2和1. 8yM，比 其母分子P巧抑菌作用还强大。因此，我们选择Pt5e进行下面实验。分析Pt5e抗革藍氏 阴性细菌公.C(97i和K<3/7卵i77aru诚iv及革藍氏阳性细菌awe化、公.况和必 作用，发现Pt5e可W显著抑制各种所测试细菌的生长，具有广谱抑菌活性。Pt5e抗 菌活性具有热稳定性，其作用100度处理10分钟，不会受到影响。
[0013] (3)Pt5e破坏细菌细胞壁 采用流式细胞仪和电子显微镜分析Pt5e对公.co7i和5： 化细胞影响。结果表 明；Pt5e可W造成公.co7i和5： 化细胞壁损伤，使细胞壁变薄甚至造成细胞壁破坏， 失去完整性。Pt5e还可W造成细胞质流出细胞外。
[0014] (4 )Pt5e结合LI^S和LTA 免疫酶标法（ELISA)分析重组表达多肤Pt5e与LI^S和LTA的结合。结果表明；Pt5e可W与革藍氏阴性细菌表面保守分子LI^S结合，也可W与革藍氏阳性细菌表面保守分子LTA 务主厶 台口口 〇
[0015] (5) Pt5e抑制LPS-处理的RAW264. 7细胞分泌TNF-a LPS处理大鼠巨瞻细胞RAW264. 7会分泌炎症因子TNF-a。我们发现；Pt5e可W显著抑 制LPS处理的大鼠巨瞻细胞RAW264. 7分泌TNF-a，该证明Pt5e具有中和内毒素的功能。
[0016] (6 )Pt5e对RAW264. 7 细胞无毒性 采用MIT法测试重组表达多肤Pt5e对RAW264. 7细胞成活率影响。结果表明；Pt5e对 大鼠RAW264. 7生长没有影响，对大鼠RAW264. 7细胞无毒性。
[0017] (7)Pt5e对人血红细胞没有破坏作用 溶血作用分析表明；重组表达多肤Pt5e对人人血红细胞无毒，不会造成血红细胞溶 解，没有溶血作用。
[001引（8)Pt5e保护内毒素血症小鼠 采用内毒素血症小鼠模型研究重组表达多肤Pt5e对其保护作用。结果表明；Pt5e可W保护体内注射LI^S诱导的内毒素血症小鼠，使其死亡率显著降低，保护率可达60%W上。 [001引表1 ;定点突变所用的引物。
【主权项】
1. 一种具有抗菌活性的高磷蛋白衍生多肽Pt5e，其特征在于编码的DNA核苷酸序列 为： Tctcgtatgtctaagactgccaccatcattgagcctttcaggaaattccacaaagatcggtacttggcaca ccatagcgccacaaaggatactagcagtggaagtgctgcagctagctttgaacaaatgcagaaacagaatctatt ccttggaaatgatattcca； 其氨基酸序列为： SRMSKTATIIEPFRKFHKDRYLAHHSATKDTSSGSAAASFEQMQKQNLFLGNDIP； 所述的高磷蛋白衍生多肽Pt5e，具体是利用基因定点突变，构建表达载体导入大肠杆 菌诱导表达；通过亲和层析纯化重组表达多肽。
2. 权利要求1所述高磷蛋白衍生多肽Pt5e，其特征在于其具有广谱抗菌作用可用于治 疗败血症。
【专利摘要】本发明发现了一种新型具有中和内毒素作用的重组抗菌多肽的设计、重组表达和制备技术。该技术采用定点突变、表达载体构建、诱导表达和亲和层析，分离纯化重组多肽。高磷蛋白衍生抗菌多肽Pt5e具有广谱抗菌作用；中和内毒素作用；抑制炎症因子TNF-α分泌；并能显著提高内毒素血症小鼠成活率，且无细胞毒和溶血等副作用，是一种具有良好应用前景的治疗败血症的药物。应用该技术可以生产新型中和内毒素抗菌多肽，成本低，对环境无污染。
【IPC分类】C12N15-12, A61P7-04, C07K14-46
【公开号】CN104774842
【申请号】CN201510138106
【发明人】张士璀, 胡立立, 宿烽
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年3月27日