春化基因Vrn-D1c、其鉴定引物及Vrn-D1c基因型小麦的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，设及一种与小麦开花和抽穗相关的基因，尤其设及一 种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因松其鉴定引物及松基因型小麦的鉴 定方法。
【背景技术】
[0002] 春化基因是决定小麦全生育期进度的重要基因，春化作用决定着小麦的开花期和 抽穗期，对小麦在不同环境条件下的适应性具有显著的影响。对春化基因的研究一直是 植物遗传研究的一个重要课题，特别是近年来植物基因组学的发展及新的高精度高通量 分子生物学技术手段的应用，使得对植物的春化基因研究取得了巨大的进展。目前研究 表明，春化作用的主效基因被定位在5号染色体的长臂上【Law,C.N.，Worland,A.J.， Giorgi,B. (1975).Thegeneticcontrolofear-emergencetimebychromosomes5A and5Dofwheat.Heredity. 36, 49-584 ;Yan,L. ,Loukoianov,A. ,Tranquilli,G., Helguera,M. ,Fahima,T. ,Dubcovsky,J. (2003).Positionalcloningofthewheat vernalizationgeneWA7.Proc.化1:1.Acad.Sci. 100, 6263-6268】，并已经相继发现 了多个春化作用主效基因等位变异类型，不同变异类型之间对春化作用的贡献也有明显差 异，对开花期和抽穗期的影响也有明显的差异。产量是小麦育种中最为重要的育种目标，而 产量不仅仅受与产量性状直接相关的基因所调控，而且还受到与小麦生育期和成熟期相关 基因的影响。冬小麦品种需要春化处理才能够正常的开花和成熟，开花期和抽穗期的早晚 影响着小麦的适应性和产量，因此，挖掘不同春化作用等位变异基因能够对小麦育种提供 重要的信息。
[0003] 而之前多项研究也均表明，春化作用的发现维持在DNA水平，不同等位变异主要 是由于基因片段的插入、缺失和SNP，一般直接利用PCR技术直接用于鉴定和分析等位变异 类型，因此，进一步明确该等位变异类型的分子机制，并开发相应的分子标记，从而使用分 子标记筛选的方法进行性状改良将会大大加快我国的小麦育种进程。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明提供了一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因化n-Wc、 其鉴定引物及松基因型小麦的鉴定方法，本发明鉴定引物可用于鉴定该春化基因 型小麦和小麦分子标记辅助选择育种等方面，可直接在分子水平上进行该春化基因型的检 巧。，对小麦发育基因的改良及优良品种的培育起到重要作用。
[0005] 为解决上述问题，本发明通过W下技术方案实现： 分离鉴定出了一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因松包括SEQIDNO. 1所 示的核巧酸序列。
[0006] 设计一种上述春化基因化n-Wc的检测引物，包括W下引物对： 上游引物；5' -CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3' ； 下游引物；5' -AGGATGGCCAGGCCAAAACG-3'。
[0007] 设计一种松n-Wc基因型小麦的鉴定方法，包括W下步骤： 1) W待测小麦的基因组DNA为模板，用上述检测引物进行PCR扩增； 2) 检测所得扩增产物，出现786bp条带的待测小麦为松基因型小麦，该小麦的基 因组dm中具有SEQIDNO. 1所示核巧酸序列，其启动子上游-6(Ubp位点有174bp片段的 插入，即SEQIDNO. 1的第157~330bp所示核巧酸序列；检测所得扩增产物，出现约61化口 的条带的待测小麦为非化/7-Wc基因型小麦，其基因组DNA中具有SEQIDNO. 2所示核巧 酸序列。
[0008] 对于上述的鉴定方法，所述PCR扩增中的反应体系由W下试剂组成；1. 5mmol/L (终浓度）MgCl2,0. 3mmol/L(终浓度）dNTP，上、下游引物各lOpmol，模板DM200ng，0.抓 賠魂I，加1XPCR缓冲液定容至25化。
[0009] 对于上述的鉴定方法，所述PCR扩增中反应程序为；先95 °C预变性5min，然后 94°C变性60s、58°C退火60s、72°C延伸Imin，如此进行35个循环；最后，72°C延伸10min。
[0010] 对于上述的鉴定方法，所述扩增引物的检测方法为：取所得扩增产物lOuL进行 琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统扫描成像并用计算机进行分析。
[0011] 本发明的积极有益效果： 本发明公开了一个能导致小麦提前开花和抽穗的春化基因松及其在小麦产量 性状改良中的应用，含有松n-Wc基因的小麦品种主要表现在抽穗和开花较KT/7-W基因的 小麦品种的早。例如，与具有kt/7-W基因的小麦品种鲁麦19相比，具有松n-Wc基因的小 麦品种豫农876在春化条件下抽穗和开花早1. 0天和0天，在未春化条件下抽穗和开花早 44天和46天。因此，松基因功能的发现能对利用基因工程技术改良小麦农艺性状和 培育高产小麦品种起到十分重要作用，同时也有助于产量性状的遗传和分子生物学的进一 步研究。
[0012] 本发明提供的鉴定方法可W应用于高产小麦新品种培育和优异种质资源的创制， 实现早期筛选，节省时间和资源。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明鉴定方法中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图； 其中，从左向右，第1泳道为DNAladderDL2000,第2、3和4泳道为小麦品种新麦18， 第5和6泳道为小麦品种双吉2号，第7和8泳道为小麦品种双吉4号，第9为小麦品种 京双16,第10泳道为小麦品种鲁麦14,第11泳道为DNAladderDL2000;左右箭头依次为 C基因和KT/7 基因。
【具体实施方式】
[0014]W下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不局限于下述具 体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。
[0015] 小麦材料为来自黄淮麦区的205份有代表性的当地大规模种植的普通小麦品种 和局代品系，具体如下（ZM编号为国豕种质资源库编号）； 新麦18 ;河南农业大学；参考文献；张清海、王志和、张桂兰，黄淮南片小麦申请推广品 种及其选育，中国农业科技出版社，2000 ; 1-401。
[0016] 山农413863 ;河南农业大学；参考文献；马东钦、王晓伟、许兰杰、朱有朋、詹克慧、 王冬梅，黄淮麦区部分小麦种质资源中矮杆基因的分布，河南农业大学学报，2009,43 (2)。
[0017] 鲁麦19 ;河南农业大学；参考文献；曹学昌，旱地小麦新品种鲁麦19号的选育及 配套技术，山东农业科学，1993,4 ;23-23。
[0018] 晋麦50 ;河南农业大学；参考文献；刘新月、张久刚、卫云宗，优质抗旱小麦新品种 晋麦78号的选育，山西农业科学，2007,4 ;35-37。
[0019] 偃展4110;河南农业大学；参考文献；邵玉华，播期、密度、施肥对偃展4110产量 形成及产量的影响，安徽农学通报，2008,14 ;74-75。
[0020] 豫农202 ;河南农业大学；参考文献；孙继冰，小麦新品种豫农202最佳播期研究， 种业导刊，2009,6 ;20-21。"豫农202"为河南农业大学农学院小麦分子育种室2007年育成 的小麦品种。
[0021] 实施例1不同品种小麦性状的调查 每年4~6月田间调查每个品种的抽穗期和开花期，结果为3年数据。调查结果见表 1 (表中，皿为抽穗时间，抑为开花时间）。
[0022] 表1小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表
[0023] 表1续1小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表
[0024] 表1续2小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表
[00巧]表1续3小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表
[0026] 表1续4小麦品种的抽穗期和开花期调查结果表
【主权项】
1. 一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因包括SEQIDNO. 1所示的核苷 酸序列。
2. -种权利要求1所述春化基因的检测引物，包括以下引物对： 上游引物：5' -CGACCCGGGCGGCACGAGTG-3' ； 下游引物：5' -AGGATGGCCAGGCCAAAACG-3'。
3. -种基因型小麦的鉴定方法，包括以下步骤： 1) 以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2所述检测引物进行PCR扩增； 2) 检测所得扩增产物，出现786bp条带的待测小麦为基因型小麦；检测所得 扩增产物，不出现786bp条带的待测小麦为非基因型小麦。
4. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中的反应体系由以 下含量的原料组成：1. 5mmol/LMgCl2,0. 3mmol/LdNTP，上、下游引物各lOpmol，模板DNA200ng，0. 5U 加IXPCR缓冲液定容至 25ML。
5. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增中反应程序为：先95°C 预变性5min，然后95°C变性60s、58°C退火60s、72°C延伸lmin，如此进行35个循环；最后， 72°C延伸 10min。
6. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述扩增引物的检测方法为：取所得 扩增产物10UL进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后用凝胶成像系统扫描成像并用计算机进 行分析。
7. -种基因型小麦的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 以待测小麦的基因组DNA为模板，用权利要求2所述检测引物进行PCR扩增； 2) 检测所得扩增产物，出现612bp条带的待测小麦为基因型小麦。
【专利摘要】本发明涉及一种导致小麦提前开花和抽穗的春化基因Vrn-D1c及其鉴定引物和鉴定方法。鉴定Vrn-D1c基因型小麦的特异性引物对为：5’- CGACCCGGGCGGCACGAGTG -3’和5’- AGGATGGCCAGGCCAAAACG -3’；以待测小麦的基因组DNA为模板，用该引物进行PCR扩增，检测出扩增产物中出现786bp条带的为Vrn-D1c基因型小麦，反之则不是。本发明鉴定引物可应用于鉴定Vrn-D1c基因型小麦和小麦分子标记辅助选择育种等方面，可直接在分子水平上进行Vrn-D1c基因型的检测，对小麦发育基因的改良及优良品种的培育起到重要作用。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11, C12N15-29
【公开号】CN104774851
【申请号】CN201510196198
【发明人】陈锋, 张香粉, 崔党群, 董中东
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月23日