一种马面鲀鱼皮锌螯合肽的用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水产品多肽的应用用途，尤其涉及一种马面飩鱼皮锌螯合肽的用途。
【背景技术】
[0002]马面飩俗名橡皮鱼、剥皮鱼，隶属于飩形目、革飩科，是我国的一种常见鱼类。马面飩皮较厚且硬，无食用价值，多数扔掉，造成资源的浪费和环境污染。锌是人体必须的微量元素，儿童锌缺乏可导致生长发育不良、智力发育落后、免疫力降低等病症；孕妇缺锌，胎儿畸形率增高。传统的锌补充剂如硫酸锌和葡萄糖酸锌等吸收利用率低，肠胃刺激大，不利于长期服用。而锌螯合肽即可促进锌的吸收利用，同时又能满足机体对活性肽、氨基酸等的需求，而且无副作用，得到了广泛关注。
[0003]但是，申请人发现，以马面飩鱼皮为原料制备马面飩鱼皮锌螯合肽及其工艺、产品功能的研宄处于空白。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种具有较强的锌螯合能力马面飩鱼皮锌螯合肽用于制备补锌保健食品、补锌功能产品的用途。
[0005]该马面飩鱼皮锌螯合肽，ES1-MS测定分子量为1034.09 Da,该多肽的氨基酸序列为 Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)0
[0006]该马面飩鱼皮锌螯合肽的制备方法，包括以下步骤:
I)马面飩鱼皮明胶的制备:将马面飩鱼皮绞碎，按照料液比I g: 15?20 mL加入到
0.3?0.5%的NaOH溶液中搅拌5?8 h，用双蒸水洗至中性；然后按照I g: 10?15 mL加入到0.3?0.5%的仏504中，室温浸泡2 d，每8 h换水一次；最后将处理过的鱼皮匀浆，按照料液比I g:8?10 mL加入到双蒸水中，于70°C动态提取12?15 h，然后于6 OOOg离心25?30 min，取上清液，冻干得马面飩鱼皮明胶。
[0007])马面飩鱼皮明胶的酶解:将马面飩鱼皮明胶按照料液比Ig:8?12 mL加入到巴比妥钠-盐酸中，调pH值至7.0，于45?50°C保温5?10 min，按照鱼皮质量的2?3%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于45?50°C酶解3?5 h，将溶液升温至90?95°C，并于此温度保持5?10 min后，冷却至35?40°C ;调溶液pH值至8.0，按照明胶质量的
1.5?2.0%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，于温度35?40°C下酶解3?4 h，将溶液升温至90?95°C，并于此温度保持10?15min后，10 OOOg离心15?20 min，取上清液，即为酶解产物；
3)马面飩鱼皮锌螯合肽的制备:将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到马面飩鱼皮锌螯合肽。
[0008]作为优选，所述步骤I)中的马面飩为绿鳍马面飩(/ferat/oz? septentr1nalis)。
[0009]作为改进，所述步骤3)的固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化的具体过程为:
固定化锌离子亲和层析:将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为8?10 mg/mL的溶液，经过固定化锌离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用3?5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；
RP-HPLC纯化:将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成100?120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对锌离子的螯合活性得I个高Zn螯合活性多肽Gly-P1-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)0
[0010]优选，所述RP-HPLC条件为:进样量10?15 μ L ;色谱柱为Gemini C18 (250 X
4.6mm, 5 μ m);柱温为25?30 °C ;流动相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脱速度0.5?
0.8 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
[0011]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明选用中性蛋白酶和胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，制得的多肽具有较强的锌螯合能力，且具有易于消化吸收和安全无毒副作用等优点，可用作补锌药品、保健食品或功能产品O
[0012]
【附图说明】
[0013]图1是本发明的固定化锌离子亲和层析酶解物的RP-HPLC色谱图。
[0014]
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]一种马面飩鱼皮锌螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下:马面飩鱼皮〃脱非胶原蛋白、脱钙、提取明胶"酶解"超滤"固定化锌离子亲和层析"高效液相色谱纯化"锌螯合肽〃结构鉴定、活性评价。
[0017]实施例:
I)马面飩鱼皮明胶的制备:将绿鳍马面飩(#arai/o/7 septentr1nalis)鱼皮绞碎，按照料液比I g: 15 mL加入到0.3%的NaOH溶液中搅拌5 h，用双蒸水洗至中性；然后按照Ig:10 mL加入到0.4%的H2SO4中，室温浸泡2 d，每8 h换水一次；最后将处理过的鱼皮匀浆，按照料液比1:10加入到双蒸水中，于70°C动态提取15 h，于6 OOOg离心30 min,取上清液，冻干得马面飩鱼皮明胶。
[0018])马面飩鱼皮明胶的酶解:将马面飩鱼皮明胶按照料液比Ig: 12 mL加入到巴比妥钠-盐酸缓冲液中，调pH值至7.0，于50°C保温10 min,按照鱼皮质量的2%加入中性蛋白酶(1.0 X 15 U/g)，于50°C酶解3 h，将溶液升温至90°C，并于此温度保持15min后，冷却至37°C ;调溶液pH值至8.0，按照明胶质量的1.5%向溶液中加入胰蛋白酶(1.9X104 U/g)，于温度37°C下酶解4 h，将溶液升温至95°C，并于此温度保持1min后，10 OOOg离心15min，取上清液，即为酶解产物； 3)马面飩鱼皮锌螯合肽的制备:将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液依次经固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，得到马面飩鱼皮锌螯合肽。
[0019]①固定化锌离子亲和层析:将上述超滤酶解液溶于双蒸水配成浓度为8?10 mg/mL的溶液，经过固定化锌离子Sepharose 6B亲和层析柱吸附后，用3?5倍柱体积双蒸水洗脱除去未吸附的多肽，然后用5?8倍柱体积的pH 3.0的双蒸水洗脱层析柱，收集洗脱液，冻干，得亲和层析酶解物；
②RP-HPLC纯化:将上述亲和层析酶解物用双蒸水配成120 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件:进样量15 UL ;色谱柱为Gemini C18 (250 X 4.6mm, 5 μπι);柱温为30 °C ;流动相30%乙腈(含0.1%三氟乙酸);洗脱速度0.8 mL/min ;紫外检测波长220nm)，根据对锌离子的螯合活性得I个高Zn螯合活性多肽(图1)。
[0020]③结构检测:收集Zn螯合活性最高的多肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为 Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG),ES1-MS测定分子量为1034.09 Da。
[0021]Zn螯合肽对锌离子的螯合作用采用EDTA滴定法测定。取待测样品100 mg放入到100 mL烧杯中，加水50 mL和HCl (6 mol/L)数滴，在水浴上加热使样品完全溶解，冷却后定容至100 mL，从中吸取10 mL于三角瓶，平行3份，加入10 mL的NH3-NH4Cl缓冲液(pH10)，铬黑T作指示剂，然后用Na2EDTA溶液(0.01 mol/L)滴定至蓝色，记录消耗EDTA的毫升数，计算螯合物含锌量。
[0022]测定结果表明:纯化得到的Zn螯合胶原肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly (GPYGPFGPffG)对锌离子的螯合能力为56.74 μ g/mg，与马面飩鱼皮明胶酶解物(23.97 μ g/mg)相比其对Zn的螯合能力有了显著提高。
[0023]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种马面飩鱼皮锌螯合肽的用途，其特征在于该马面飩鱼皮锌螯合肽用于制备补锌保健食品或补锌功能产品的用途。
2.根据权利要求1所述的一种马面飩鱼皮锌螯合肽的用途，其特征在于所述的马面飩鱼皮锌螯合肽的氨基酸序列为 Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly，ES1-MS 测定分子量为1034.09 Da0
【专利摘要】本发明涉及一种马面鲀鱼皮锌螯合肽用于补锌药物或者功能产品的开发的用途。该多肽是以马面鲀鱼皮为原料，采用酸碱脱除鱼皮非胶原蛋白和矿物质后提取鱼皮明胶，利用中性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼皮明胶进行酶解，采用超滤、固定化锌离子亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化得到锌螯合肽Gly-Pro-Tyr-Gly-Pro-Phe-Gly-Pro-Trp-Gly（GPYGPFGPWG），ESI-MS测定分子量为1034.09Da。
【IPC分类】C07K1-22, C12P21-06, C07K14-78, C07K1-20, C07K1-36, C07K1-34
【公开号】CN104774897
【申请号】CN201510177346
【发明人】迟长凤, 王斌, 陈荫, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月15日