检测无乳链球菌的引物、试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物的检测方法，特别是设及检测无乳链球菌的引物、试剂盒和方 法。
【背景技术】
[0002]无乳链球菌（Str巧tococ州Sagalactiae，Sa)，是一种0溶血链球菌，寄居于人 的下消化道及泌尿生殖道。在成年女性的阴道和直肠内有15% -40%可W检测出无乳链球 菌，北京协和医院分析2001-2009年女性生殖道细菌的分布情况，发现无乳链球菌成为除 大肠埃希菌外，最常见的生殖道细菌，导致该类女性分娩的新生儿感染该菌的比例会比较 局。
[0003] 邓江红等对北京儿童医院234例死亡新生儿的肺组织石蜡标本进行了无乳链球 菌检测，其检出率为65%，指出无乳链球菌是新生儿肺炎死亡的主要病原菌。其他相关研究 也提出无乳链球菌是导致母婴感染的重要菌。
[0004] 因此，找到一种简单、快速、经济的无乳链球菌检测方法，成为当前研究的热点之 〇
[0005] 目前无乳链球菌的研究多用PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果，存在耗时长，灵 敏度低等缺点；目前临床上应用的恒温扩增大多数采用肉眼根据浊度判断结果，导致假阴 性率高；而且不同反应管之间可能有气溶胶污染造成假阳性等缺陷。
[0006] 随着人们对于分子生物领域的不断深入研究，一种全新的核酸扩增技术一一环介 导等温扩增技术（Loopmediatedisothermalamplification,Lamp)越来越受到研究人员 的亲睐。该方法是在2000年由日本学者Notomi等首先提出，其特点是针对祀基因的6个 独立区域设计两对特异引物，在链置换DNA聚合酶炬StDNApolymerase)的作用下，恒温 水浴化0~65°C)30~60min可将原有几个拷贝的祀核酸扩增到109水平。
[0007] 目前国内尚未有实时巧光环介导恒温扩增巧ea^Timefluorescence Loop-MediatedIsothermalAmplification,Rea-Lamp)检测无乳链球菌的相关研究。
【发明内容】
[0008] 基于此，本发明的目的之一提供一种实时巧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌 的试剂盒。
[0009] 实现上述目的的技术方案如下。
[0010] 一种实时巧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒，包括有序列组成为 SEQID.NO. 1-2的内引物，序列组成为SEQID.NO. 3-4的外引物，序列组成为SEQID.NO. 5-6的 环引物。
[0011] 在其中一个实施例中，还包括有巧光染料，
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种检测无乳链球菌的引物。
[0013] 实现上述目的的技术方案如下。
[0014] 一种检测无乳链球菌的引物，包括有序列组成为SEQID.no. 1-2的内引物，序列组 成为SEQID.NO. 3-4的外引物，序列组成为SEQID.NO. 5-6的环引物。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种检测无乳链球菌的方法。
[0016] 实现上述目的的技术方案如下。
[0017] 一种检测无乳链球菌的方法，采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒，包括W下 步骤：
[0018] (1)提取待检测样品的基因组；
[0019] (2)加样和加巧光染料后，进行环介导恒温扩增；
[0020] (3)检测扩增产物。
[0021] 在其中一个实施例中，所述内引物、外引物和环引物在扩增的反应体系中的浓度 分别为 1. 6UM、0. 2UM、0. 8UM。
[0022] 本发明具有W下优点；本发明针对无乳链球菌的化sB基因设计筛选得到的特 异性的LAMP引物，对无乳链球菌的祀标基因具有很好的扩增效率。对非无乳链球菌进行 Rea-Lamp的扩增，均未出现非特异性的扩增，说明该引物对无乳链球菌有较好的扩增能力。 而且，本发明所述的实时巧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒灵敏度高，扩增 引物对纯培养物中的无乳链球菌的灵敏度可达到3(K)pg/ul。进行重复性试验，结果显示具 有很好的重复性。本发明所述的实时巧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒即检 巧巧法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快捷、便于批量检测等特点，为无乳链球菌的检 测提供了新的发展方向。
【附图说明】
[0023] 图1为实施例2中的Rea-Lamp反应条件。
[0024] 图2为实施例2中的Rea-Lamp扩增曲线。
[0025] 图3为实施例3中Rea-Lamp引物特异性的实验结果示意图。
[0026] 图4为实施例4中的Rea-Lamp引物敏感性的实验结果示意图。
[0027] 图5为实施例4的溶解曲线图。
[0028] 图6为实施例5中的Rea-Lamp重复性实验结果示意图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0030] 应理解，该些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆；实验室 手册（NewYork:ColdSpringHarborL油oratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0031] 菌株来源；W下实施例中所用到的菌株由广州医科大学附属第S医院检验科微生 物室分离、VIT邸2全自动微生物鉴定仪鉴定并于-70°C保存。
[0032] 实验用菌株如下；无乳链球菌、化脈性链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、罗伦特隐球菌、 铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球 园、副洛血弧园。
[0033] 实施例1
[0034] 本发明的实时巧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒中的引物如表1 所示。该引物序列由购自英潍捷基上海贸易有限公司合成。
[0035] 表1无乳链球菌化SB基因引物
[0036]
【主权项】
1. 一种实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，包括有序 列组成为SEQID.NO. 1-SEQID.NO. 2的内引物，序列组成为SEQID.NO. 3-SEQID.NO. 4的外引 物，序列组成为SEQID.NO. 5-SEQID.NO. 6的环引物。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有荧光染料SYT0-9。
3. -种检测无乳链球菌的引物，其特征在于，包括有序列组成为SEQID.NO. 1-SEQID. NO. 2的内引物，序列组成为SEQID.NO. 3-SEQID.NO. 4的外引物，序列组成为SEQID. NO. 5-SEQID.NO. 6 的环引物。
4. 一种检测无乳链球菌的方法，其特征在于，采用权利要求1-2任一项所述的试剂盒， 包括以下步骤： (1) 提取待检测样品的基因组； (2) 加样和加荧光染料后构成反应体系，进行环介导恒温扩增； (3) 检测扩增产物。
5. 根据权利要求4所述的检测无乳链球菌的方法，其特征在于，所述内引物、外引物和 环引物在反应体系中的浓度分别为I. 6UM、0. 2UM、0. 8UM。
【专利摘要】本发明提供了一种实时荧光环介导恒温扩增法检测无乳链球菌的引物、试剂盒以及方法，所述检测试剂盒包括有序列组成为SEQID.NO.1-2的内引物，序列组成为SEQID.NO.3-4的外引物，序列组成为SEQID.NO.5-6的环引物。本发明所述的试剂盒和检测方法特异性强，与非目标菌不存在交叉反应；灵敏度高，可达300pg/ul；重复性好，实验结果稳定可靠。
【IPC分类】C12Q1-14, C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104774961
【申请号】CN201510212128
【发明人】郭旭光, 夏勇, 刘美玲, 陈琼, 唐晓华, 邓穗燕, 林丽英
【申请人】郭旭光
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月29日