可乐定半抗原、抗原及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可乐定半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用，属于生物化 工领域。
【背景技术】
[0002] 可乐定（(：1〇111乜1^)化学名称为2-[(2,6-二氯苯基)亚氨基]咪唑烷盐酸盐，别 名可乐宁，氯压定，催压降，血压得平，110降压片，可乐亭，压泰生，英文别名2, 6-dichloro -N-(2-imidazolin_2-yl)aniline。分子式C9H9C12N3 ;分子量：230. 1。可乐定为白色结晶性 粉末；无臭。在水中或乙醇中溶解，在氯仿中极微溶解，在乙醚中几乎不溶，熔点为305°C。 可乐定是一种抗高血压药物，其药理作用主要为通过刺激脑干a2-肾上腺受体导致交感 神经从中枢神经系统的传出减少，从而降低外周阻力、肾血管阻力、心率以及血压。可乐定 口服吸收迅速，约50%在肝脏代谢，代谢物为对羟基可乐定和葡萄糖醛酸酯，对羟基可乐定 不能通过血脑屏障，无降压活性；20%~40%以原型和代谢物的形式从尿中排出；约20%从 粪便中排出。自2006年起在国内的饲料产品中已发现有添加的趋势，分析其作用机理应与 瘦肉精等0受体激动剂类似，以提高饲料转化率达到增重的效果。2010年4月23日北京 市怀柔区的北京水岸山吧餐饮有限责任公司发生的急性集体可乐定中毒事件已经引起全 社会的高度重视。目前，可乐定对动物促生长及增重的作用已有文献报道，在国内已发现 将这种药物违法添加在猪饲料中，2010年12月农业部1519号公告已明确把可乐定列入了 《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》清单，世界卫生组织、美国、欧盟及一些发达国家等 都禁止违法使用可乐定。其常见的副作用有口干、瞌睡、头晕、镇静、呼吸抑制等。食用含有 可乐定残留的动物源性产品，对人体健康具有一定的危害性，对儿童的作用更为明显。
[0003]目前国内外大多采用高效液相色谱法、气相色谱法测定，这些方法特异性强、灵敏 度高、但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。免疫 化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较 高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。可乐定人工抗原的制备为这一方法的实 施奠定了重要基础。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性 质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗 体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可乐定人工抗原及其制备方法与应用。
[0005] 本发明所提供的可乐定人工抗原，是将可乐定半抗原与载体蛋白偶联获得的抗 原。
[0006] 可乐定半抗原是一种化合物，其结构为式I所示。
【主权项】
1. 一种可乐定半抗原，为式I所示产物： 式I。
2. 式I所示产物的制备方法，包括如下步骤： 将lOOmg阿可乐定和49mg己酵酸溶于己醇中，室温揽拌16h，减压浓缩； 使用制备薄层色谱分离纯化，展开剂二氯甲焼；甲醇（V/V) =5:1，得白色固体CLD-EC0。
3. -种可乐定抗原，是将式I所示产物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
4. 权利要求3所述可乐定抗原的制备方法，包括如下步骤： (1) 取式I所示产物13mg，溶解于2mL二甲基甲醜胺中，磁力揽拌使其充分溶解； (2) 取步骤1溶液，加入17mg1-己基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（邸C)和 15mgN-羟基玻巧醜亚胺（N服），室温活化反应化； (3) 称取载体蛋白50mg，加入0.Imol/L碳酸氨轴缓冲溶液4ml，揽拌使其充分溶解； (4) 将活化液加入到蛋白溶液中，室温反应过夜； (5) 用0.Olmol/L的磯酸盐缓冲液于4C透析3d，每天换3次透析液，W除去未反应的 小分子物质； (6) 分装，于-2(TC保存备用。
5. 权利要求3所述可乐定抗原在制备可乐定特异性抗体中的应用。
6. 应用权利要求3所述可乐定抗原制备得到的特异性抗体。
7. 权利要求1所述产物、权利要求3所述可乐定抗原、权利要求6所述抗体在检测可乐 定中的应用。
8. 应用权利要求1所述产物、权利要求3所述可乐定抗原、权利要求6所述特异性抗体 制备得到的酶联免疫检测试剂盒。
9. 权利要求8所述酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有可乐定抗原的酶 标板、酶标抗体工作液、可乐定系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涂液。
【专利摘要】本发明公开了一种可乐定半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体，同时本发明也公开了所述可乐定半抗原，相应的人工抗原和单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明提供的可乐定半抗原是式Ⅰ所示产物，用式Ⅰ所示产物与载体蛋白连接可以得到可乐定抗原。所述可乐定抗原可应用于制备可乐定特异性抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高。本发明的可乐定人工抗原，通过免疫动物可产生了针对可乐定的特异性抗体，可用于制备检测可乐定残留的酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。
【IPC分类】C07K14-765, G01N33-577, C07K1-107, C07K14-795, C07K16-44, C07K14-77, C07D233-88, G01N33-531, C07K14-47
【公开号】CN104788383
【申请号】CN201410021591
【发明人】王世恩, 江海洋, 温凯, 吴小平, 张桂亮, 金兴, 杨艳红, 成芳, 沈星辰, 邢佑尚, 许舒婷, 姚琳
【申请人】北京维德维康生物技术有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月17日