卵黄低密度脂蛋白的提取及与利福喷丁的融合技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及卵黄低密度脂蛋白的提取方法及与利福喷丁的融合技术。
【背景技术】
[0002]鸡卵黄中低密度脂蛋白含量丰富，约为68%。卵黄低密度脂蛋白与人血浆低密度脂蛋白相似，具有球形颗粒结构，直径为17-60nm，密度为0.982g/mL，其非极性脂质核心由胆固醇酯和甘油三酯组成，表面覆盖有磷脂、游离胆固醇和载脂蛋白。脂蛋白的外层极性磷脂单层及非极性的脂质核心结构使其既能够运载脂溶性药物，也能运载水溶性药物，而且脂蛋白的直径较小，能够穿过血管壁进入血管外组织。这些优点使其作为潜在的药物载体越来越受到重视。同时卵黄低密度脂蛋白还广泛被开发用于食品乳化剂和精子的冷冻保存。
[0003]已有的卵黄低密度脂蛋白提取方法使用大量硫酸氨，容易引起脂蛋白变性，而且需要超速离心，耗时长、效率低。
【发明内容】
[0004]本发明以亲和层析取代超速离心，其目的是提供一种简便、快速、可以批量提取卵黄低密度脂蛋白的方法，从而为科学研究和生产应用提供大量性质稳定的原材料。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供了一种新的卵黄低密度脂蛋白的提取方法，该方法包括如下步骤:(I)新鲜鸡蛋去除蛋清和黏着在蛋黄膜上的白色卵带。收集蛋黄到一个冷却的无菌烧杯中，加入二倍体积150mM NaCl溶液稀释，混合液在4°C用磁力搅拌器搅拌lh，10000g，4°C，离心45min，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，弃去沉淀物，在相同条件下离心后，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，加入四倍体积150mM NaCl溶液稀释。(2)将蛋黄衆溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。
(3)以 150mM NaCl 溶液淋洗层析柱至基线，流速 1.5mL/min。(4)以 IM NaCl,pH7.4,0.02%NaN3溶液洗脱层析柱，流速为1.5mL/min，接收0D280nm >基线的洗脱物即为卵黄低密度脂蛋白。(5)将IM NaCl洗脱物对150mM NaCl,0.02% NaN3溶液透析24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000-14000Da。(6)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
[0006]本发明还提供了一种脂蛋白与利福喷丁的融合技术，该方法包括:(1)利福喷丁溶液的制备，称取0.025g利福喷丁，加入ImL无水乙醇和1.5 μ L1N NaOH，药物溶解后，力口Λ PBS(137mM NaCl,3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4, pH7.4)溶液，定容至 50mL，利福喷丁终浓度=500 μ g/mL，0.22 μ m滤膜过滤除菌。(2)将利福喷丁溶液与卵黄低密度脂蛋白按体积比3: I进行混合，37°C避光放置30min，4°C避光放置12h。(3)将该混合溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。(4)以150mMNaCl溶液淋洗层析柱至基线，流速1.5mL/min。(5)以IMNaCl，ρΗ7.4,0.02% NaN3溶液洗脱层析柱，流速为1.5mL/min，接收0D280nm >基线的洗脱物。(6)将IM NaCl洗脱物对150mMNaCl，0.02% NaN3溶液透析24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000_14000Da。
(7)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
[0007]本发明还提供了上述硫酸葡聚糖纤维素填料重复利用的清洗方法，如下:(1)以2M NaCl,pH7.4,0.02% NaN3溶液淋洗硫酸葡聚糖纤维素填料填充的层析柱至基线，流速为1.5mL/min。(2)以5倍柱体积的150mM NaCl溶液淋洗层析柱，流速3mL/min。(3)以5倍柱体积0.1N NaOH溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(4)以PBSA溶液(137mM NaCl, 3mMKCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02% NaN3, ρΗ7.4)淋洗层析柱至 pH 达到 7.4。(5)以 5倍柱体积0.1N HCl溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(6)以PBSA溶液(137mM NaCl, 3mMKCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02% NaN3, ρΗ7.4)淋洗层析柱至 pH 达到 7.4。
【附图说明】
[0008]图1本发明卵黄低密度脂蛋白(左)及与利福喷丁的融合药物(右)液体图片；
[0009]图2本发明卵黄低密度脂蛋白(左)及与利福喷丁的融合药物(右)SDS-PAGE电泳图片；
[0010]图3本发明卵黄低密度脂蛋白(上)及与利福喷丁的融合药物(下)扫描电镜图；
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0012]本发明提供了一种新的卵黄低密度脂蛋白的提取方法，该方法包括如下步骤:
(I)新鲜鸡蛋I枚，去除蛋清和黏着在蛋黄膜上的白色卵带。收集蛋黄到一个冷却的无菌烧杯中(约15mL)，加入30mL150mM NaCl溶液稀释，混合液在F用磁力搅拌器搅拌lh，1000g, 40C，离心45min，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，弃去沉淀物，在相同条件下离心后，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，加入180mL150mM NaCl溶液稀释。⑵将60mL蛋黄浆溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。(3)以150mM NaCl溶液淋洗层析柱至基线，流速1.5mL/min。(4)以IM NaCl, pH7.4,0.02%NaN3溶液洗脱层析柱，流速为1.5mL/min，接收0D280nm >基线的洗脱物即为卵黄低密度脂蛋白。(5)将该 IM NaCl 洗脱物(每 20mL)对 150mM NaCl, 0.02% NaN3 溶液(IL)透析 24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000-14000Da。(6)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
[0013]卵黄低密度脂蛋白与利福喷丁的融合，该方法包括:(I)利福喷丁溶液的制备，称取0.075g利福喷丁，加入3mL无水乙醇和4.5 μ L1N NaOH,药物溶解后，加入PBS (137mMNaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4, ρΗ7.4)溶液，定容至 150mL，利福喷丁终浓度=500yg/mL,0.22 μ m滤膜过滤除菌。⑵将150mL利福喷丁溶液与50mL卵黄低密度脂蛋白混合，37°C避光放置30min，4°C避光放置12h。(3)将该混合溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。(4)以150mM NaCl溶液淋洗层析柱至基线，流速1.5mL/min。(5)以IM NaCl, ρΗ7.4,0.02% NaN3溶液洗脱层析柱，流速为1.5mL/min，接收 0D280nm >基线的洗脱物。(6)将 IM NaCl 洗脱物对 150mM NaCl,0.02%NaN3溶液透析24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000_14000Da。所得卵黄低密度脂蛋白-利福喷丁的融合效率为60-150 μ g利福喷丁/mg卵黄低密度脂蛋白(7)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
[0014]硫酸葡聚糖纤维素填料重复利用的清洗方法，如下:(1)以2M NaCl, pH7.4,0.02%似％溶液淋洗层析柱至基线，流速为1.5111171^11。(2)以125mL150mM NaCl溶液淋洗层析柱，流速3mL/min。(3)以125mL0.1N NaOH溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(4)以PBSA溶液(137mM NaCl，3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02% NaN3,pH7.4)淋洗层析柱至pH达到7.4。(5)以125mL0.1N HCl溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(6)以PBSA溶液(137mM NaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02% NaN3, pH7.4)淋洗层析柱至pH达到7.4。
【主权项】
1.一种卵黄低密度脂蛋白的制备方法，该方法包括如下步骤: (1)新鲜鸡蛋去除蛋清和黏着在蛋黄膜上的白色卵带。收集蛋黄到一个冷却的无菌烧杯中，加入二倍体积150mM NaCl溶液稀释，混合液在4°C用磁力搅拌器搅拌lh，1000g,4°C，离心45min，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，弃去沉淀物，在相同条件下离心后，将蛋黄浆溶液转移到新的离心管，加入四倍体积150mM NaCl溶液稀释。 (2)将蛋黄浆溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。 (3)以150mMNaCl溶液淋洗层析柱至基线，流速1.5mL/min。(4)以IM NaCl，pH7.4,0.02% NaN3 溶液洗脱层析柱，流速为 1.5mL/min，接收 0D280nm>基线的洗脱物。 (5)将IMNaCl洗脱物对150mM NaCl,0.02% NaN3溶液透析24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000-14000Da。 (6)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
2.一种卵黄低密度脂蛋白与利福喷丁的融合技术，该方法包括: (1)利福喷丁溶液的制备，称取0.025g利福喷丁，加入ImL无水乙醇和1.5 μ LlONNaOH，药物溶解后，加入PBS(137mM NaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,pH7.4)溶液，定容至50mL，利福喷丁终浓度=500 μ g/mL，0.22 μ m滤膜过滤除菌。 (2)将利福喷丁溶液与卵黄低密度脂蛋白按体积比3: I进行混合，37°C避光放置30min，4°C 避光放置 12h。 (3)将该混合溶液以1.5mL/min流速通过硫酸葡聚糖纤维素填料填充的亲和层析柱(Φ2.6*10cm)。 (4)以150mMNaCl溶液淋洗层析柱至基线，流速1.5mL/min。(5)以IM NaCl，pH7.4,0.02% NaN3 溶液洗脱层析柱，流速为 1.5mL/min，接收 0D280nm>基线的洗脱物。 (6)将IMNaCl洗脱物对150mM NaCl,0.02% NaN3溶液透析24h，中间换2次透析液，透析袋截留分子量为8000-14000Da。 (7)可选择使用PEG20000对产物进行浓缩，0.22 μ m滤膜过滤除菌。
3.根据权利要求1，2所述的提取方法中，硫酸葡聚糖纤维素填料重复利用的清洗方法如下: (1)以2MNaCl, ρΗ7.4,0.02% NaN3溶液淋洗层析柱至基线，流速为1.5mL/min。 (2)以5倍柱体积的150mMNaCl溶液淋洗层析柱，流速3mL/min。 (3)以5倍柱体积的0.1N NaOH溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(4)以PBSA溶夜(137mMNaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02%NaN3,pH7.4)淋洗层析柱至pH达到7.4。 (5)以5倍柱体积的0.1N HCl溶液淋洗层析柱，流速1.5mL/min。(6)以PBSA溶液(137mMNaCl, 3mM KCl,8mM Na2HPO4,1.5mM KH2PO4,0.02%NaN3,pH7.4)淋洗层析柱至pH达到7.4。
【专利摘要】本发明涉及一种新的卵黄低密度脂蛋白的提取方法及其与利福喷丁的融合技术，其中卵黄低密度脂蛋白的提取包括：(1)蛋黄浆的制备；(2)硫酸葡聚糖纤维素亲和层析提取卵黄低密度脂蛋白；(3)透析除去盐分。卵黄低密度脂蛋白与利福喷丁的融合技术为：(1)利福喷丁水溶液的制备；(2)卵黄低密度脂蛋白与利福喷丁的融合；(3)硫酸葡聚糖纤维素亲和层析纯化融合药物；(4)透析除去盐分。本发明制备方法简单，反应条件温和，提取效率高，设备简单易控，所得卵黄低密度脂蛋白及其与利福喷丁的融合药物稳定性好，可应用于卵黄低密度脂蛋白提取、药物运载和食品乳化剂加工等领域。
【IPC分类】C07K1-107, C07K1-36, C07K14-775, C07K1-22, C07K1-34
【公开号】CN104788558
【申请号】CN201410030635
【发明人】韩润林, 杨金丽, 李雨欣, 刘恩, 白文成
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月22日