一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌ab-2及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一株分离自四川泡菜中的植物乳杆菌菌株（Lactobaci 1 lus plantarum AB-2)和以该菌株为发酵剂或添加剂的发酵乳制品及其它健康保健食品中的应 用。 技术背景
[0002] 随着公众卫生和安全意识的提升，食品安全问题被越来越多的公众所重视，因食 品安全问题可能会导致重大的经济损失，严重危害人体健康和社会治安。这其中食品微生 物污染问题是食品安全的主要问题之一。食品微生物的污染主要是细菌污染，特别是常见 致病性的单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和伤寒沙门氏菌等细菌均能引起 食源性疾病，现在这一问题已经引起了公众的注意，普通的化学药物治疗方法又易使致病 菌产生抗药性、药物残留和治疗效果不佳等缺陷。乳酸菌被用于多种发酵食品加工，已被人 类食用上千年，最近的研宄表明乳酸菌能有效的抑制致病菌的生长，又因其具有稳定性、免 疫性和安全性等优势，被认为是新型食品防腐剂和保健食品研宄的重要方向。
[0003] 乳酸菌对一些肠道致病菌有较好的抑制作用。这些抑制作用可能是由于产生酸性 物质使不耐酸致病菌生长繁殖受到抑制；产生类似细菌素的小分子肽类使致病菌受到抑制 作用；产生溶菌酶、过氧化氢等物质杀死潜在的病原菌。乳酸菌可维持人体中基本的营养 物质，清除食物中的毒性物质，根除发酵食物中的病原体，清除肠道微生物产生的毒素和废 物，形成生物学屏障。然而，乳酸菌想要应用于具有抑菌功能的保健品生产，还需要对其抑 菌物质的稳定性和益生特性进行评价，其中稳定性包括在不同的PH、排除不稳定的抑菌物 质过氧化氢和对蛋白酶的稳定性，而益生特性则是要检测其在人体内应用的可行性。
【发明内容】
[0004] 本发明的另一目的在于提供一种新型乳杆菌菌株，其具有优异的作为益生菌基本 性质的耐酸性、耐胆汁酸性、过氧化氢酶的稳定性、蛋白酶稳定性和温度稳定性。
[0005] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌用于预防和治疗肠道疾病的组合物。
[0006] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌广谱抑菌活性的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在食品防腐剂和保健食品中的应用。
[0008] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在农业生物农药和果蔬保鲜剂方面的应用。
[0009] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌在整肠中的应用，具有良好的益生特性。
[0010] 本发明的另一目的是提供新型乳杆菌以作为发酵剂或添加剂在发酵乳制品及其 他健康保健食品中的应用。
[0011] 为了实现上述目的，本发明提供一株植物乳杆菌的新菌株（L. plantarum AB-2)及 其制备方法。该菌株（L. plantarum AB-2)已于2014年9月15日在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No. 9654。
[0012] 本发明的植物乳杆菌（L.plantarumAB-2)是经过筛选的、从四川泡菜中分离得到 的具有广谱抑菌活性的植物乳杆菌。
[0013] 本发明的植物乳杆菌（L. plantarum AB-2)是通过如下方法分离得到。
[0014] a.菌株分离方法：
[0015] 先将从四川采集的泡菜进行前处理，再做梯度稀释后（1(T4,1(T5, KT6)涂布于含有 放线菌酮（0. lwt %，0XID公司）和硫酸粘菌素（0. lwt %，0XID公司）的MRS琼脂培养基或 者M17琼脂培养基（0XID公司）上，30°C厌氧培养48h~72h，挑取单菌落，转接于TPY增菌 培养液中，30°C培养24h~48h，划线接种于MRS琼脂培养基（0XID)，30°C培养24h~48h， 观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征，并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏染 色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌，暂定为乳酸菌。将菌株接种于MRS液体培养基中，37°C 培养24h~48h后，做进一步鉴定和保存。
[0016] b?分子生物学鉴定：
[0017] 本发明的植物乳杆菌（L. plantarum AB-2)是通过如下方法进行分子生物学鉴定 的。将冷冻保存的供试菌株接种于TPY液体培养基中，30 °C恒温培养24h，经TPY传代培 养2~3代后，取2mL对数生长末期的菌体培养物置于无菌EP管内离心，经8000 X g离心 3min(4°C )后收集菌体，弃上清，采用乳酸菌专用CTAB冻融法提取菌株的基因组DNA。
[0018] 采用通用引物，正向引物是27f (对应于Escherichia coil 8-27位碱基）： 5 ' -AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3 反向引物是 1495r(对应于 Escherichia coil 1495-1515 位碱基）：5 ' -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 '，以菌体 DNA 为扩增模板 PCR 扩增 16S rRNA基因区域，扩增产物经纯化后进行16S rRNA基因序列测定，然后通过基因序列比 对和系统发育关系研宄进行种属鉴定。所得菌株显示出了与植物乳杆菌最高的分子系统学 上的亲缘关系。将上述微生物鉴定为植物乳杆菌，命名为L. plantarum AB-2。植物乳杆菌 L. plantarum AB-2的系统发育树状图见图3〇
[0019] c?形态学特性：
[0020] 本发明的植物乳杆菌L. plantarum AB-2具有如下形态学特征：细胞呈直杆状，有 圆形末端，长3. 0-8. 0 y m，宽0? 9-1. 2 y m，呈单个、成对，或短链状出现（见图1)，有些菌能 减少硝酸盐，偶尔有些菌株表现出拟过氧化氢酶活性。
[0021] d.菌落形态特性：
[0022] 本发明的植物乳杆菌L. plantarum AB-2在MRS琼脂培养基上生长形成乳白色菌 落，不透明，圆形，表面光滑，中央凸起，直径约为1.2-1. 5mm(见图2)。
[0023] 植物乳杆菌（L. plantarum) AB-2抑菌性能测定
[0024] e.植物乳杆菌MRS发酵上清的制备方法
[0025] 以广泛采集的347株植物乳杆菌作为筛选具有抑制致病菌活性植物乳杆菌的来 源并进行对比，该347株植物乳杆菌由内蒙古农业大学"乳品生物技术与工程"教育部重点 实验室提供，它们分别分离自内蒙古、新疆、青海、西藏、甘肃、云南、四川以及蒙古国地区的 传统发酵食品中。把冻存管中的保藏液接种到5mL的MRS液体培养基中，震荡混匀，37°C恒 温培养24h，以2%的接种量连续活化三代，取第三代的发酵液以4000Xg离心10min，取上 清，上清液经0. 22 y m微膜过滤，-20°C冰箱保存备用。
[0026] f.指示菌浓度的确定：
[0027] 将活化好的5株指示菌（单细胞李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7、 伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌）按2% (V/V)接入各自培养基中，37°C发酵24h，使菌体充分 富集，以MRS为培养基用平板计数法计数。得到计数结果后，将肠道致病菌菌液制成104、 105、10 6、107的指示菌细胞悬液，以乳酸调节pH为4. 0的MRS无细胞悬液为标准，利用打孔 琼脂扩散法，确定抑菌圈最易观测的肠道致病菌的生长量作为指示菌悬液的最佳浓度，最 终确定1〇 6为最佳观测浓度，指示菌菌落生长情况见表1。
[0028] 表1不同浓度指示菌的抑菌效果
【主权项】
1. 一株具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)AB_2,已于2014 年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号 为CGMCCNo. 9654。
2. 含有权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)AB_2的组合物。
3. 权利要求1所述的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)AB_2在抑制致病菌中的 应用，所述细菌为： (1) 大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌或单细胞李斯特氏菌； 或者 (2) 甜瓜疫霉菌。
4. 权利要求1所述的植物乳杆菌在食品防腐剂中的应用。
5. 权利要求1所述的植物乳杆菌在农业生物农药或果蔬保鲜剂中的应用。
6. 权利要求1所述的植物乳杆菌作为发酵剂或食品添加剂在保健食品中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述保健食品是发酵食品。
8. 权利要求1所述的植物乳杆菌在制备预防或治疗肠道疾病的药物中的用途。
9. 权利要求1所述的植物乳杆菌在动物饲料中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有广谱抑菌特性的植物乳杆菌，该菌被命名为Lactobacillus plantarum AB-2，已于2014年09月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.9654。本发明的植物乳杆菌在MRS液体培养基培养的条件下表现出较强的广谱抑菌特性，且该菌株有较好益生特性，其MRS发酵上清液经不同pH、过氧化氢酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后依然能表现出较好的广谱抑菌特性，最终证明其有较好的广谱抑菌特性和在人体肠道存活能力。CGMCC No.965420140915
【IPC分类】C12N1-20, A23L3-3571, A61K35-747, C12R1-25, A61P31-04, A23L1-30, A61P31-10, A23K1-16
【公开号】CN104789511
【申请号】CN201510230679
【发明人】陈永福, 张和平, 李常坤
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月8日