转基因大豆品系呼交06-698的检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种转基因大豆品系呼交06-698的检 测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 2010年全球转基因作物种植面积达1. 48亿hm2,其中以抗草甘膦转基因大豆商品 化种植面积最大。据报道，美国、阿根廷和巴西抗草甘膦大豆播种面积分别占其大豆总种植 面积的91%、99%和71%。草甘膦是一种非选择性内吸型有机磷类广谱除草剂，它的作用是特 异性地抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶（EPSPS)的活性。种植抗草甘膦大豆使灭 生性药剂草甘膦在大豆田苗后喷施成为可能。其在扩大杀草谱、减轻除草剂土壤残留危害、 降低种植成本等方面起到了较大作用。转基因作物在给人们带来巨大经济效益和社会效益 的同时，其安全性也让各国民众产生担忧，引起广泛争论和全社会高度关注。世界各国纷纷 采取措施加强对转基因生物研发、生产、加工和进出口等过程中的安全监管，以保障生态安 全和人类健康。我国针对转基因生物的安全性问题也制定了一系列法律法规和管理办法， 对其实行安全评价、生产许可、产品标识、进口许可和快速而精准的检测是这一制度顺利实 施的前提和保障。我国2001年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》，其中第四章第 二十八条明确规定，在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物标识目录的农业转基 因生物，应当有明显的标识。因此，为转基因产品实施标签制度的定量检测技术显得尤为重 要。
[0003] 由于国外转基因大豆品种不能在国内直接种植，利用通过材料转移协议获得的抗 除草剂转基因大豆种质AG5601为父本、以中作92121 (中黄11)为母本进行杂交，培育出携 带有抗性基因CP4EPSPS的抗草甘膦除草剂大豆新品系N03-1。利用N03-1为父本与蒙豆 13杂交，选育出呼交02-92,再与蒙豆12杂交和2次回交。后代经过喷洒草甘膦除草剂鉴 定抗性和分子生物学检测，选育出携带有CP4EPSPS基因、抗草甘膦且综合性状好的转基因 大ii新品系呼父06-698。
[0004] 本发明根据转基因大豆新品系呼交06-698侧翼序列设计引物探针，用于检测转 基因大豆呼交06-698。利用该方法，在实时荧光PCR结束后即能判断所检测大豆样品是否 为转基因大豆品系呼交06-698。
【发明内容】
[0005] 为完善转基因产品实施标签制度的定量检测技术，本发明的目的是提供一种转基 因大豆品系呼交06-698的检测方法及试剂盒。
[0006] 本发明所用TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5'末 端，而淬灭剂则在3'末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶 活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到 荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产 物形成完全同步。通过这种方法，就能够检测到样品中是否有转基因大豆品系呼交06-698。
[0007] 本发明提供用于转基因大豆品系呼交06-698的检测方法的一对特异性引物，其 为：
[0008]正向引物：5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3'（如 SEQ IDNO. 1 所示）；
[0009]反向引物：5'-GGCAITTGTAGGAGCCACCTT-3'（如 SEQ IDNO.2所示）。
[0010] 本发明提供用于转基因大豆品系呼交06-698的检测方法的荧光探针，其核苷酸 序列如序列表SEQ IDNo. 3所示，5'端标记有报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。
[0011] 其中，所述报告突光集团选自Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、Fite、Cy3、Cy5等中的一种。
[0012] 其中，所述淬灭突光基团选自Tamra、Rox、Dabcy、Bhql、Bhq2、MGBNFQ等中的一种。
[0013] 本发明提供的转基因大豆品系呼交06-698的检测方法，具体步骤如下：
[0014] 以待测大豆样品的总DNA为模板，以一对特异性引物和荧光探针进行实时荧光 PCR扩增，每个循环结束记录荧光信号的数据，反应结束后根据数据绘制扩增曲线，检测到 荧光信号的则为转基因大豆品系呼交06-698;
[0015] 所述一对特异性引物，其为：
[0016]正向引物：5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3'（如 SEQ IDNO. 1 所示）；
[0017]反向引物：5'-GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3'（如 SEQ IDNO.2所示）；
[0018] 所述荧光探针的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 3所示，其5'端标记有报告荧光 基团，3'端标记有淬灭荧光基团。
[0019] 其中，所述实时荧光PCR的反应体系如下：
【主权项】
1. 用于转基因大豆品系呼交06-698的检测方法的一对特异性引物，其特征在于，其 为： 正向引物；5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3' 巧nSEQIDNO. 1 所示）； 反向引物；5' -GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3' 巧nSEQIDNO. 2 所示）。
2. 用于转基因大豆品系呼交06-698的检测方法的英光探针，其特征在于，其核巧酸序 列如序列表SEQIDNo. 3所示，5'端标记有报告英光基团，3'端标记有浑灭英光基团。
3. 如权利要求2所述的英光探针，其特征在于，所述报告英光集团选自Fam、化X、Tet、 Joe、Vic、Fite、Cy3、C巧中的一种。
4. 如权利要求2所述的英光探针，其特征在于，所述浑灭英光基团选自Tamra、Rox、 D油巧、Bhql、Miq2、MGBNFQ中的一种。
5. 转基因大豆品系呼交06-698的检测方法，其特征在于，具体步骤如下： W待测大豆样品的总DNA为模板，W-对特异性引物和英光探针进行实时英光PCR扩 增，每个循环结束记录英光信号的数据，反应结束后根据数据绘制扩增曲线，检测到英光信 号的则为转基因大互?品系呼义06-698; 所述一对特异性引物，其为： 正向引物；5' -TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT-3' 巧nSEQIDNO. 1 所示）； 反向引物；5' -GGCATTTGTAGGAGCCACCTT-3' 巧nSEQIDNO. 2 所示）； 所述英光探针的核巧酸序列如序列表SEQIDNo. 3所示，其5'端标记有报告英光基团， 3'端标记有浑灭英光基团。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时英光PCR的反应体系如下： 特异性引物终浓度 0.2ymol/L 巧光探针终浓度 0.1nmol/L Mix 12.5^il DNA样品终浓度 50ng/叫 Wdd&0补充反应体系总体积至25y1。
7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时英光PCR的反应条件为： 5(TC2min;95°ClOmin;95°C15s、55°CImin，共 45 个循环。
8. 用于所述转基因大豆品系呼交06-698检测方法的试剂盒，其特征在于，包括下列组 分；摩尔比2:1的特异性引物对和英光探针。
9. 权利要求5-7任一项所述的方法在转基因大豆检测中的应用。
10. 权利要求8所述的试剂盒在转基因大豆检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种转基因大豆品系呼交06-698的检测方法，具体步骤为：以待测大豆样品的总DNA为模板，以一对特异性引物和荧光探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束记录荧光信号的数据，反应结束后根据数据绘制扩增曲线，检测到荧光信号的则为转基因大豆品系呼交06-698。本发明还提供用于转基因大豆品系呼交06-698的检测方法的试剂盒。本发明的检测方法准确性高，反应灵敏，可以快速检测样品是否含有转基因大豆品系呼交06-698，为转基因安全提供保障。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104789646
【申请号】CN201410028464
【发明人】付伟, 杜智欣, 彭萱子, 邱丽娟, 朱水芳
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年1月21日