一种基于pcr制备粘性未端dna组装产物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产 物的方法。
【背景技术】
[0002] 将两个或更多DNA片段按照设计组装在一起一直是生物学研宄中非常基础且重 要的一步。在启动子和外显子功能研宄、蛋白质功能研宄以及基因操作等传统领域中DNA 连接技术都有广泛的应用。而在合成生物学这门新兴学科中，DNA连接更是成为许多研宄 必不可少的核心步骤。尽管一系列相关手段已经被开发出来，其中包括经典的type II型限 制酶技术及同源重组技术等，他们都旨在获得更高的效率、准确度、适用性和通量，但直到 现在，DNA连接技术仍然在平末端片段连接、一次性连接数量、连接长度、酶切位点依赖以及 片段处理方面有着诸多限制，依然有很大的改进余地。本发明开发的一种新型DNA连接技 术，在插入大片段的定点突变、载体构建、敲除基因片段以及嵌合编码序列上具有独特的优 势。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在提供一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，利用PCR方法 产生长短不一样的PCR产物，把PCR产物经过变性和复性过程，就可形成粘性未端的可连 接低物。
[0004] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0005] -种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，通过两对PCR扩增引物进行扩 增，将两种产物混合在一起，高温条件下将PCR产物变性为单链DNA，在99°C条件下缓慢复 性30s，形成具有粘性未端的DNA组装产物，在连接酶作用下，具有粘性未端的DNA组装产物 之间进行组装。
[0006] 所述的连接酶为T7连接酶，反应条件为：1X T7DNA连接酶反应缓冲液[66mM Tris-HCl，lmM ATP，10mM MgCl2，lmM DTT，7.5%PEG 6000(pH 7.6@25°C )]，25°C温育。
[0007] 本发明所述的两对PCR扩增引物所扩增的目标序列一样，但组装端的引物比另一 条引物多出1个或1个以上碱基。
[0008] 本发明组装端的引物5'末端进行磷酸化修饰或不经修饰，所述的引物扩增后产物 利用DNA激酶作用使5'末端带有磷酸基团。
[0009] 本发明的有益效果为：由于双链粘性未端是通过PCR方法产生，与传统内切酶方 法相比，可以不需要内切酶的使用，因此，对序列是无特殊要求，可应用于任何核酸序列的 组装，该方法按采用常规的分子生物学方法进行，所需要的试剂和仪器均为常用，无需特殊 购买。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0011] 实施例1
[0012] 一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，BDNF基因第100-106氨 基酸序列删除突变，已知BDNF的蛋白编码区序列如SEQ IDNO. 1。其中要删除序列为： GAGCTTTGTGTGGACCCTGAG。具体通过以下方法：
[0013] 1)用Trizol法提取大鼠 VTA区总RNA。
[0014] 2)利用反转录引物T(18)(因绝大多数真核细胞mRNA 3'端具有Poly(A)尾， Oligo (dT)与其配对，仅mRNA可被反转录）及反转录试剂盒，把RNA转为cDNA。
[0015] 3)在PCR反应体系中加入cDNA，以及表1所示引物组合（PCR反应体系为高保真聚 合酶的常规 PCR 反应）：bdnf 1 和 bdnf2 ;bdnf 1 和 bdnf3 ;bdnf4 和 bdnf6 ;bdnf5 和 bdnf6 ; 进行30个循环扩增，分别得到扩增产物1，扩增产物2,扩增产物3,扩增产物4。
[0016] 4)把扩增产物1和扩增产物2,以及扩增产物3和扩增产物4分别混合在一起，经 过纯化，然后把产物加热到99°C进行变性处理，缓慢降低温度，完成复性过程。
[0017] 5)把复性产物再一次混合，在DNA连接酶（T7连接酶，反应体系如上所述）作用下 可完成制备BDNF基因突变体。
[0018] 表 1 引物序列（见序列表1 :bdnfl, bdnf2, bdnf3, bdnf4, bdnf5, bdnf6)
[0019]
【主权项】
1. 一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，其特征在于包括以下步骤：将两 对PCR扩增引物进行扩增，两种产物混合，高温条件下将PCR产物变性为单链DNA，在99°C 条件下缓慢复性30s，形成具有粘性未端的DNA组装产物，在连接酶作用下，具有粘性未端 的DNA组装产物之间进行组装。
2. 根据权利要求1所述的一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，其特征 在于：所述的连接酶为17连接酶，反应条件为：66mM Tris-HCl，ImM ATP，IOmM MgCl2, ImM DTT，7. 5% PEG6000,25°C温育。
3. 根据权利要求1所述的一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，其特征在 于：所述的两对PCR扩增引物所扩增的目标序列一样，且组装端的引物比另一条引物多出1 个或1个以上碱基。
4. 根据权利要求1所述的一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，其特征在 于：所述的两对PCR扩增引物扩增后产物利用DNA激酶作用使5'末端带有磷酸基团。
【专利摘要】本发明公开了一种基于PCR制备粘性未端DNA组装产物的方法，通过两对PCR扩增引物进行扩增，然后对两种产物混合在一起，高温条件下把PCR产物变性为单链DNA，然后缓慢复性，从而形成一些具有粘性未端的DNA组装产物，与此粘性未端相连接的另一组装产可以按以上方法制备，当在连接酶作用下，可以很容易进行两产物的组装。为DNA分子的组装提供一种新方法。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104805072
【申请号】CN201510188136
【发明人】曹君利, 张松, 宋昱, 郭羽白, 周笑, 李燕强
【申请人】徐州医学院
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月20日