源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶，尤其是涉及一种源于红树林沉积 物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备。
【背景技术】
[0002] 孔雀石绿（Malachite Green，MG)是一种三苯基甲烷类染料，应用于造纸业、纺织 业和皮革业。而其因具有高效的抗菌作用也被广泛应用于养殖业。但近年来的研宄表明孔 雀石绿对哺乳动物细胞有极强的致癌性和致畸变性（Fessard et al. 1999 ;Srivastava et al. 2004)，因此已被许多国家禁止使用。然而由于孔雀石绿在拮抗水产病原菌方面的有效 性且缺乏合适的替代物，导致其仍被大量使用，由此对近海生态环境和人类健康造成了很 大程度的威胁。
[0003] 过氧化物酶（Peroxidase, EC 1. 11. 1)是一类以有机物为底物的氧化酶类， 通过夺取其电子并传递给活性氧基团以达到清除自由基、保护细胞的作用（Thomas et al. 1980)，同时过氧化物酶也与工业染料等大分子物质降解相关。Anirban等发现辣根过 氧化物酶可以降解多种工业染料（Anirban et al. 2001)，同时Ramesh等和Liaquat等 均发现一些微生物和动物来源的过氧化物酶对大分子物质有着降解的作用（Anirban et al.2001;Ramesh et al.2013;Liaquat et al.2013)。专利方面，多种来源的过氧化物酶被 应用于定量、显色和化学修饰等领域，但通过红树林沉积物宏基因组测序得到的过氧化物 酶应用于孔雀石绿降解及环境修复上并不多见。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的是提供一种源于红树林沉积物的过氧化酶基因 mgv-peroxidase〇
[0005] 本发明的第二目的是提供一种由所述过氧化酶基因 mgv-peroxidase编码的过氧 化物酶Mgv-rPOD。
[0006] 本发明的第三目的是提供所述过氧化物酶Mgv-rPOD的制备方法。
[0007] 本发明的第四目的是提供所述过氧化物酶Mgv-rPOD在对孔雀石绿降解中的应 用。
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] 源于红树林沉积物的过氧化酶基因 mgv-peroxidase，所述过氧化物酶基因来源于 红树林沉积物宏基因组序列；
[0010] 所述过氧化物酶基因 mgv-peroxidase的序列（SEQ ID No. 1)如下：
[0011]
【主权项】
1. 源于红树林沉积物的过氧化酶基因mgv-peroxidase，其特征在于，所述过氧化物酶 基因来源于红树林沉积物宏基因组序列； 所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase的序列（SEQ ID No. 1)如下： atgtcctgga ttgacgagat tgaaatcgac gaagccgatg gccgcctggG cgaaatttac 60 aaggagttag tcgaaaagcg cggcaaggt.c tccaacatcc tcaaggtgca cagcct.caac 120 cccgaggcga tgtctggtca cctggacctc tacatgacac tgatgttcgg caagtccggc 180 ctgagccgcg ccgaacgcga agcgattggc gtggtcgtct cggcagaaaa. cgattgcgca 240 tactgcgtga accatcatgc cgaggcttta aagcatttca tcaaggacga ggaaacgctg 300 actatgctga tgaccgcaga cgggctggag acgctcgagc cgcgcctgtc caatatcgtt 360 cgccatgcgg aaaagctcac ctctgccccc gaggccatga ccgaatccga tctcggcgaa 4ZU ctcagggctg tgggcctgag cgaccaggac atactcgacc tgacgctcat cgcggcgtat 480 ttcaat-tttg tcaatcgtct- cgtcct-tggc ctcggcgtcg agtac飞cgga agaggaagtc 540 gcgggctatc tcaacgactg a 561 SEQ ID No. 1 的信息： 1) 名称：过氧化物酶基因mgv-peroxidase ; 2) 分子类型：DNA ; 3) 序列特征： A) 长度：561bp ; B) 类型：核酸； C) 链性：双链； D) 拓扑结构：线性。
2. 如权利要求1所述过氧化酶基因mgv-peroxidase编码的过氧化物酶Mgv-rPOD，其 特征在于，其氨基酸序列（SEQ ID No. 2)如下： MSWIDEIEID EADGRLAEIY KELVEKRGKV SNILKVHSLN PEAMSGHLDL YMTLMFGKSG 60 LSRAEREAIG VVVSAENDCA YCVNHHAEAL KHFIKDEETL TMLMTADGLE TLEPRLSN1V 120 RHAEKLTSAP EAMTESDLGE LRAVGLSDQD ILDLTLIAAY FNFVNRLVLG LGVEYTEEEV 180 AGYLND 丄8b SEQ ID No. 2 的信息： 1) 名称：过氧化物酶Mgv-rPOD ; 2) 分子类型：蛋白质； 3) 序列特征： A) 长度：186aa ; B) 类型：氨基酸。
3. 如权利要求2所述过氧化物酶Mgv-rPOD的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)克隆所述过氧化物酶基因mgv-peroxidase ; 2) 将所述mgv-peroxidase插入表达载体，构建携带所述过mgv-peroxidase的重组表 达载体； 3) 将所述重组表达载体转化到E. coli BL21(DE3)中； 4) 选取转化后E. coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养； 5) 离心收集发酵后的E. coli BL21(DE3)细胞，重悬所述E. coli BL21(DE3)细胞于裂 解缓冲液中进行裂解； 6) 将步骤5)中裂解后的悬液进行离心，收集上清液； 7) 将上清液与将上清液与预先结合附304的RIO-Flammable混匀，4°C结合45分钟，用 浓度为200mM的咪唑洗脱即得所述过氧化物酶Mgv-rPOD。
4. 如权利要求3所述过氧化物酶的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述表达载体 为pET-32a载体。
5. 如权利要求3所述过氧化物酶的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养基为 含有1〇〇1^/1^氨苄青霉素和0.7%葡萄糖的2\￥1'培养基。
6. 如权利要求3所述过氧化物酶的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵条件 为：37°C下振荡培养至A_= 0. 5,加入异丙基硫代-0-D-半乳糖苷至终浓度为ImM，而后 于25°C诱导10小时。
7. 如权利要求3所述过氧化物酶的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述裂解缓冲 液配方为：〇? 5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH8. 0。
8. 如权利要求3所述过氧化物酶的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述离心的条 件为 4000rpm，离心 20min。
9. 如权利要求3所述的过氧化物酶在降解孔雀石绿中的应用。
【专利摘要】源于红树林沉积物的可降解孔雀石绿的过氧化物酶及制备，涉及一种过氧化物酶，过氧化物酶基因来自红树林沉积物微生物宏基因组序列。克隆过氧化物酶基因，再插入表达载体，构建携带过氧化物酶的重组表达载体；将重组表达载体转化到E.coli BL21(DE3)中；选取转化后E.coli BL21(DE3)中的阳性克隆于培养基中发酵培养；离心收集发酵后的E.coli BL21(DE3)细胞，重悬E.coli BL21(DE3)细胞于裂解缓冲液中裂解，离心，收集上清液，再与预先结合NiSO4的R10-Flammable混匀，咪唑洗脱，得过氧化物Mgv-rPOD。所得过氧化物酶对孔雀石绿具有显著降解活性。
【IPC分类】A62D3-02, C12N15-70, C12N15-53, A62D101-26, C12N9-08
【公开号】CN104805098
【申请号】CN201510264312
【发明人】赵晶, 曲武
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月22日