一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种慢病毒载体，尤其是一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体及 其构建方法。
【背景技术】
[0002] 慢病毒载体是由人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV)改造而 来，它最大限度的消除了 HIV的致病性，且不能自我复制，带有人工合成的外源基因和人工 改良的病毒外衣。慢病毒载体的优点是1)可以感染多种细胞系，包括分裂与非分裂时期的 细胞；2)极小的毒性和免疫反应；3)高效率地整合到宿主基因组内，形成稳定的外源基因 表达，非常适合建立稳定的转基因小鼠和人ES细胞系。
[0003] 常规基因研究的主要方法是将外源基因导入到细胞内使其过表达，或者通过基因 敲除和RNA干扰方法使其低表达，然后分析细胞以及生物体所发生的表型改变和内在基因 表达变化，从而推断基因的功能和作用。如今随着人类基因组图谱基本完成，后续研究重点 已经从基因水平移到了蛋白水平，人们发现蛋白的后修饰和突变比基因组更加复杂，也更 重要。常规的单纯过表达人工改造的基因并不能消除内源基因的干扰，而单纯RNA干扰又 不能研究具体哪一个氨基酸在该蛋白中的发挥着重要作用。如果同时进行RNA干扰和过表 达人工改造的基因，常规方法需要用两步法先后干扰和过表达基因，操作非常繁琐。而且如 果该基因对细胞存活极其重要，往往无法得到干扰或过表达的中间产物，使整个实验无法 进行。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种一步法高效替换细胞内基因的慢病 毒载体及其构建方法。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种新型替代内源基因表达的慢病毒载 体具有以下结构：采用载体PLL3. 7、pUC18和Iv-Lin28-GFP (上海斯丹赛）作为原始质粒， 在慢病毒5'和3'LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区含有 BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列；EFla启动子转录表达Flag标签融 合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆位点含有HpaI、EcoRI和NheI3种 酶切位点用于插入外源基因，其中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入；IRES用 于启动表达EGFP报告基因；实现一条由EFla转录的RNA可以产生两个蛋白，即过表达外源 蛋白和EGFP。
[0006] 这种新型替代内源基因表达的慢病毒载体的构建方法如下：
[0007] DpUC-EFla-IRES-EGFP载体的构建：对EFla-IRES-EGFP元件进行克隆，将克隆得 到的EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI双酶切，选择pUC18作为原始质粒，用EcoRI和PstI 双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EFla-IRES-EGFP元件进行连接；
[0008] 2)pLL3. 7-CQ载体的构建：设计合成正反向引物 ENZYfl (5, -TGGATCCGCGCGGTGACC-3'）和 ENZYrl (5, -TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3'）用于 形成shRNA插入位点，正反向双链的退火，选择慢病毒载体pLL3. 7作为原始质粒，用HpaI 和XhoI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接；
[0009] 3)pUC-Flag-EGFP 载体的构建：设计合成正反向引物 FlagF(5' -GATCAGCCACCATGG ACTACAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3'）和 FlagR (5' -CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATC GTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3'）用于形成带有Flag标签的多克隆位点，正反向双链的退 火，选择PUC-EFla-IRES-EGFP作为原始质粒，用BamHI和NheI双酶切，退火产物和酶切好 的载体连接；
[0010] 4) PLenti-FlagN-ShRNA 载体的构建：对 EFla-Flag-EGFP 元件进行克隆，前面 PCR 克隆得到的EFla-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，选择慢病毒载体pLL3. 7-CQ作为原始质粒， 用NsiI和PvuII双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EFla-Flag-EGFP元件进行连接，最 终获得插入序列和方向均正确的载体即pLenti-FlagN-shRNA。
[0011] 发明有益的效果是：本发明通过shRNA干扰技术将内源基因进行RNA干扰，同时又 能够过表达外源经过改造的同一个基因，实现用人工改造的基因替代生物体内原有基因， 该载体为慢病毒载体，可以高效整合到宿主细胞内，长期高效发挥基因替代功能，克服了以 往载体的缺点，提供了 一种快速、1?效的细胞内基因改造的手段。
【附图说明】
[0012] 图 1 是 pLenti-FlagN-shRNA 的结构不意图；
[0013] 图2是将病毒感染后的NCCIT在荧光显微镜下观察和拍照示意图；
[0014] 图3是Western Blot检测内源0ct4的干扰和外源0ct4的表达情况示意图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合附图对本发明作进一步说明：
[0016] 如图1所示，本发明的慢病毒载体pLenti-FlagN-shRNA具有以下结构： 慢病毒5'和3' LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区 (ggatccgcgcggtgaccctcgag)含有BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列。 EFla启动子转录表达Flag标签融合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆 位点（GTTAACGAATTCGCTAGC)含有Hpal、EcoRI和NheI3种酶切位点用于插入外源基因，其 中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入。IRES(Internal ribosome entry site, IRES)又被称为内部核糖体进入序列，用于启动表达EGFP报告基因，实现一条由EFla转录 的RNA可以产生两个蛋白--过表达外源蛋白和EGFP。
[0017] 该慢病毒载体通过以下方法构建：
[0018] DpUC-EFla-IRES-EGFP 载体的构建
[0019] I. I. EFla-IRES-EGFP 元件的克隆
[0020] 选择慢病毒载体Iv-Lin28-GFP作为原始质粒，根据其序列设计引物IinFl (5'-G￡ AATTCACAAATGGCAGTATTCATCCACAA-3' )和 IinRl(5, -AAACTGCAG CGGCAGGCGGGGAGGC-3'）。 然后以Iv-Lin28-GFP作为PCR模板，IinFl和IinRI为引物，用高保真pfu酶进行PCR扩 增。PCR热循环程序如下：94°C变性5min，30个扩增循环（94°C变性30s，64°C退火30s，72°C 延伸6min)，最后72°C保温lOmin。
[0021] PCR产物跑电泳，用Axyprep DNA Gel Extraction Kit回收约3K的条带，即 EFla-IRES-EGFP。通过测定其紫外吸收值计算浓度。回收产物保存于-20°C。
[0022] 1. 2.前面克隆得到的EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI酶切
[0023] 在一根I. 5ml离心管内分别加入以下成分
【主权项】
1. 一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体，其特征是：这种慢病毒载体具有以下结 构：在慢病毒5'和3' LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区含有 BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列；EFla启动子转录表达Flag标签融 合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆位点含有HpaI、EcoRI和NheI3种 酶切位点用于插入外源基因，其中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入；IRES用 于启动表达EGFP报告基因；实现一条由EFla转录的RNA可以产生两个蛋白，即过表达外源 蛋白和EGFP。
2. 根据权利要求1所述的慢病毒载体的构建方法，其步骤是： 1. pUC-EF I a-1RES-EGFP载体的构建：对EFI a-1RES-EGFP元件进行克隆，将克隆得到的 EFla-IRES-EGFP用EcoRI和PstI双酶切，选择pUC18作为原始质粒，用EcoRI和PstI双酶 切，将回收得到的质粒和酶切好的EFla-IRES-EGFP元件进行连接； 2. pLL3. 7-CQ载体的构建：设计合成正反向引物ENZYfl，其序列为 5' -TGGATCCGCGCGGTGACC-3'，和 ENZYrl，其序列为 5' -TCGAGGGTCACCGCGCGGATCCA-3'，用于 形成shRNA插入位点，正反向双链的退火，选择慢病毒载体pLL3. 7作为原始质粒，用HpaI 和XhoI双酶切，退火产物和酶切好的载体连接； 3. pUC-Flag-EGFP 载体的构建：设计合成正反向引物 FlagF(5' -GATCAGCCACCATGGACTA CAAGGACGACGATGACAAGGTTAACGAATTCG-3'）和 FlagR(5'-CTAGCGAATTCGTTAACCTTGTCATCGTC GTCCTTGTAGTCCATGGTGGCT-3'）用于形成带有Flag标签的多克隆位点，正反向双链的退火， 选择pUC-EFla-IRES-EGFP作为原始质粒，用BamHI和NheI双酶切，退火产物和酶切好的载 体连接； 4. pLenti-FlagN-shRNA载体的构建：对EFla-Flag-EGFP元件进行克隆，前面PCR克隆 得到的EFla-Flag-EGFP元件用Nsil酶切，选择慢病毒载体pLL3. 7-CQ作为原始质粒，用 NsiI和PvuII双酶切，将回收得到的质粒和酶切好的EFla-Flag-EGFP元件进行连接，最终 获得插入序列和方向均正确的载体即PLenti-FlagN-shRNA。
【专利摘要】本发明涉及一种新型替代内源基因表达的慢病毒载体，在慢病毒5’和3'LTR中间插入U6启动子用于转录一段shRNA序列，shRNA插入区含有BamHI和XhoI双酶切位点，可插入退火后的shRNA序列；EFla启动子转录表达Flag标签融合的外源基因，Flag标签融合在外源基因的N端，多克隆位点含有HpaI、EcoRI和NheI3种酶切位点用于插入外源基因，其中HpaI为平末端酶切，保证任何基因都可以插入；IRES用于启动表达EGFP报告基因；实现一条由EFla转录的RNA可以产生两个蛋白，即过表达外源蛋白和EGFP。本发明克服了以往载体的缺点，提供了一种快速、高效的细胞内基因改造的手段。
【IPC分类】C12N15-66, C12N15-867
【公开号】CN104805119
【申请号】CN201410034811
【发明人】陈齐, 刘军, 谢丹
【申请人】杭州纽贝生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年1月23日