一种新型布尼亚病毒lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法。
【背景技术】
[0002] 布尼亚病毒科（Bunyaviridae)是一类有包膜负链RNA病毒，因首先从乌干达西部 的布尼亚韦拉（Bunyamwera)分离到而得名，于1975年正式命名。布尼亚病毒科是虫媒病 毒中最大的一科，其成员约有350个，并不断发现新成员。该科的大多数病毒在自然界的节 肢动物-脊椎动物间循环，可以使人和（或）动物致病的约60多种。由该科病毒引起的人 类自然疫源性疾病中，重要的有肾综合征出血热（HFRS)、汉坦病毒肺综合征（HPS)、裂谷热 (RVF)、克里米亚-刚果出血热（CCHF，国内称新疆出血热，XHF)和白蛉热（Sandfly fever) 等。
[0003] 蜱传疾病有明显季节性，4~9月为发病高峰。发病地区多位于浅山丘陵地带，草 木茂盛，硬蜱活动活跃，人们经常遭受其袭击。人群对这类传染病普遍易感，发病多为农民， 呈高度散发。近年来，在我国中原地区的河南、山东、安徽、湖北、江苏和以及辽宁、浙江等12 个省发生了近千例因被蜱叮咬而引发的媒介生物学传染病，数十人死亡。多数患者症状轻 微，少数年纪大的，自身免疫功能低下的、贻误治疗的病人临床症状危重。重症患者的症状 有高烧、头痛、幻觉、全身不适、恶心、呕吐、眼眶疼痛、腰痛、肌肉酸痛和精神萎靡等，并伴有 白细胞、血小板进行性下降等症状。2010年9月至2011年3月，我国先后有6个省份出现 发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)病例， 其中36例患者死亡。2010年9月，中国疾病预防控制中心从湖北及河南二省急性期病例中 采集血液样本作进一步的实验室检查，并组织研宄小组进行多方探索，终于在2011年3月 16日宣布分尚出一种新型布尼亚病毒，命名为SFTS布尼亚病毒，并完成了该病毒基因序列 测定和同源性比较，认定该病毒为布尼亚病毒科白蛉病毒属的新病毒，引起了国内外医学 界的高度重视。
[0004] 新型布尼亚病毒感染发病急、病情重、病死率高，同时可以通过接触病人血液等传 播，早期快速实验室确诊对于早期诊断、早期隔离、早期治疗、早期防控具有重要意义。研宄 建立新型布尼亚病毒感染的实验动物模型，进一步深入研宄其感染和发病机制、以及流行 病学特点，是研宄者面临的新任务，也是对症治疗的关键。
[0005] 目前已选用新型布尼亚病毒的S、M、L基因片段的高度保守区设计特异性引物及 探针，通过RT-PCR法对急性期（发病2周内）患者的血液样本作病毒核酸定性或定量检 测，PCR技术虽然特异性和敏感度较高，但依赖高精密度的PCR仪，实验成本较大，在大样本 人群现场检测及临床应用时受到许多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特异、快速、方 便的新型布尼亚病毒诊断方法。
[0006] LAMP法针对目的基因的6个序列区域设计4条引物，通过将需要扩增的基因样品 与引物、具有链置换活性的DNA聚合酶和底物等混合，在恒温条件下（60°C _65°C，一般选用 60°C、63°C或65°C )反砬30-60min，就能将只有几个拷贝的靶核酸分子扩增剥IO9-IOici分 子水平，该反应不需要用高温使DNA双链变成单链，整个反应过程只需在恒温水浴箱中就 可完成，反应的终产物是一种混合物，由多个不同茎长的茎-环结构的DNA组成，通过观察 副产物白色焦磷酸酶（Mg2P 2O7)沉淀的有无，就可以判断靶基因的扩增是否成功，一步即可 完成基因的扩增与产物的检测。
[0007] LAMP技术扩增，检测的目的核酸片段的大小一般以200_300bp为宜。一般的实验 流程包括：在GenBank中检索目的基因片段（并通过BLAST确定该片段与其他物种基因的 同源性）、人工或在线设计引物组、引物合成、确定反应体系、在具有链置换活性的DNA聚合 酶（若进行逆转录LAMP扩增，仅需要在DNA扩增的试剂中，再加入逆转录酶）作用下恒温 扩增和反应结果判定等。
[0008] LAMP方法突破了以往分子生物学检测技术需要昂贵的仪器设备以及复杂操作的 限制，从采集样本到得到结果的整个过程仅需lh，且灵敏度大大高于传统的检测方法，可以 用肉眼直接判断是否得到扩增产物。LAMP技术作为一种快速、简便的基因诊断方法，在新型 布尼亚检测中可替代PCR的基因扩增技术，具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效、灵敏度高、特异 性好、操作方便、价格低廉的新型布尼亚病毒LAMP检测技术方法。
[0010] 本发明一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，包括以下步骤：LAMP引物序列设计、 LAMP反应液的配制、LAMP法核酸扩增、LAMP反应产物的检测。
[0011] 所述的LAMP引物序列设计：在新型布尼亚病毒基因片段保守区域选取221-450 的靶序列，设计8条引物，在引物列表中筛选候选引物，依熵值排序，得到新型布尼亚病毒 LAMP检测的4条特异性引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物 B3 ；
[0012] 所述正向内引物FIP :3'端由F2区组成，F2区与靶基因3'端的F2c区域互补，5' 端的Flc区域序列与靶基因 Fl互补；
[0013] 所述反向内引物BIP :3'端由B2c区域组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补， 5'端的Blc区域序列与靶基因 Bl互补，
[0014] 所述正向外引物F3,与靶基因 F3c区段完全互补，
[0015] 所述反向外引物B3,与靶基因 B3c区段完全互补。
[0016] FIP:Flc-F2CAGCCCTGCAGTGCTGCTTCCTTTGGGTCTCCTGCTTAGC,
[0017] F3:AGCAGTAATGTGGTCCAGTG,
[0018] BIP:Blc-B2AGCCGACCAAATCATCATCCCATTGTCACGTCAGCCTTGC,
[0019] B3:ACCCTGCCAGTTAGCCTC。
[0020] 所述反应液配制的步骤为：在LAMP反应管中分别加入Tris -HC1、氯化钾、硫酸铵、 硫酸镁、Triton X- KKKBst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPs、甜菜碱、引物FIP、BIP、F3 和 B3、DEPC 水；
[0021] 应用RNA提取试剂提取待测样品RNA模板，在配制好的反应液中加入RNA模板、阴 性对照以DEPC水代替，混匀；
[0022] 所述的 LAMP 反应液最终为：10XThermoPol 反应液 2. 5 μ L、l. 4mmol/l 的 dNTPs 1 μ L、0. 8mol/l 甜菜喊 5 μ L、8mmol/L 硫酸儀 1 μ L、40pmol/1 FIP 1 μ L、40pmol/1 BIP I μ L、5pmol/l F31 μ L、5pmol/l B31 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、5U/μ L AMV 逆转录 酶1 μ L，在配制好的反应液中加入模板RNA 5 μ L、阴性对照以DEPC水代替；最后以DEPC水 补液至25 μ L，混匀。
[0023] 所述的LAMP法核酸扩增步骤为：加入模板RNA的反应体系经混匀后短暂离心，然 后立即放入62-65°C水浴锅中，反应40-60min，再置于80°C水浴锅中作用5min终止反应，观 察结果。
[0024] 所述的LAMP反应产物的检测方法为：肉眼观测副产物焦磷酸酶沉淀；产物呈阳性 的反应，则管内液体呈白色浑浊，阴性反应则无此现象。
[0025] 本发明实验过程中；在新型布尼亚病毒基因片段保守区域选取221-450的靶序 列，设计8条引物，在引物列表中筛选候选引物，依熵值排序，
[0026] 靶序列
[0027] 221 CTAAGCAGTA ATGTGGTCCA GTGGTCTCTT TGGGTCTCCT GCTTAGCACA GGAGCTAGCT
[0028] 281 AGTGCCCTGA AGCAGCACTG CAGGGCTGGT GAGTTCATCA TCAAGAAGCT GAAGTTCTGG 341 CCTATCTATG TCATTATCAA GCCGACCAAA TCATCATCCC ATATCTTCTT CAGCTTGGGG 401 ATCCGCAAGG CTGACGTGAC AAGGAGGCTA ACTGGCAGGG TCTTCTCTGA
[0029] 引物信息
[0030]
【主权项】
1. 一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，其特征在于包括以下步骤：LAMP引物序列设 计、LAMP反应液的配制、LAMP法核酸扩增和LAMP反应产物的检测。
2. 按照权利要求1所述的一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，其特征在于：所述的 LAMP引物序列设计：在新型布尼亚病毒基因片段保守区域选取221-450的靶序列，设计8 条引物，在引物列表中筛选候选引物，依熵值排序，得到新型布尼亚病毒LAMP检测的4条特 异性引物：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3 ; 所述正向内引物FIP :3'端由F2区组成，F2区与靶基因3'端的F2c区域互补，5'端的 Flc区域序列与靶基因Fl互补； 所述反向内引物BIP :3'端由B2c区域组成，B2区与靶基因3'端的B2c区域互补，5' 端的Blc区域序列与靶基因Bl互补， 所述正向外引物F3,与靶基因F3c区段完全互补， 所述反向外引物B3,与靶基因B3c区段完全互补； FIP:Flc-F2CAGCCCTGCAGTGCTGCTTCCTTTGGGTCTCCTGCTTAGC, F3:AGCAGTAATGTGGTCCAGTG, BIP:Blc-B2AGCCGACCAAATCATCATCCCATTGTCACGTCAGCCTTGC, B3:ACCCTGCCAGTTAGCCTC。
3. 按照权利要求1所述的一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，其特征在于：LAMP反应 液的配制步骤为： 在LAMP反应管中分别加入Tris-HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、Triton X-KKKBst DNA 聚合酶、AMV逆转录酶、dNTPs、甜菜碱、引物FIP、BIP、F3和B3、DEPC水； 应用RNA提取试剂提取待测样品RNA模板，在配制好的反应液中加入RNA模板、阴性对 照以DEPC水代替，混匀； 所述的 LAMP 反应液最终为：10 X ThermoPol 反应液 2. 5 y L、I. 4mmol/l 的 dNTPs I y L、 0.8111〇1/1甜菜喊5 1^、81111]1〇1/1^硫酸儀11^、40卩1]1〇1/1?1?11^、40卩1]1〇1/1131?11^、 5pmol/l F31yL、5pmol/l B31yL、8U/yL Bst DNA 聚合酶 lyL、5U/yL AMV 逆转录酶 I U L，在配制好的反应液中加入模板RNA 5 y L、阴性对照以DEPC水代替；最后以DEPC水补 液至25 yL，混匀。
4. 按照权利要求1所述的一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，其特征在于：所述 的LAMP法核酸扩增步骤为：加入模板RNA的反应体系经混匀后短暂离心，然后立即放入 62-65°C水浴锅中，反40-60min，再置于80°C水浴锅中作用5min终止反应。
5. 按照权利要求1所述的一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，其特征在于：所述的 LAMP反应产物的检测方法为：肉眼观测副产物焦磷酸酶沉淀；产物呈阳性的反应，则管内 液体呈白色浑浊，阴性反应则无此现象。
【专利摘要】本发明公开了一种新型布尼亚病毒LAMP检测方法，属于病原微生物检测领域。本发明包括以下步骤：LAMP引物序列设计、LAMP反应液的配制、LAMP法核酸扩增、LAMP反应产物的检测。所述LAMP引物序列为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3。本发明克服现有技术的不足之处，提供一种快速高效、灵敏度高、特异性好、操作方便、价格低廉的新型布尼亚病毒LAMP检测方法。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-93
【公开号】CN104805220
【申请号】CN201510222504
【发明人】董雪, 王秋雨
【申请人】沈阳市疾病预防控制中心
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月5日