一种蚕蛹羧甲基壳聚糖、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，涉及一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备工艺，具体涉 及一种以蚕蛹为原料的能有效预防术后肠粘连的抗粘连剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 术后粘连既是外科领域常见的临床现象，也是术后愈合过程必然发生的病理生 理过程。有研宄表明，腹腔手术后肠粘连的发病率高达60%-90%，更有其中5%~10%患者 有发生粘连性肠梗阻的可能(参见文献：王吉甫.胃肠外科学.北京：人民卫生出版社， 2000)。目前，预防肠粘连的药物有很多，各有优缺点，其中，粘性溶液在预防腹膜粘连方 面是一个重要研宄方向（参见文献：YeoY,ItoT,BellasE,etal.AnnSurg. 2007， 245(5)，819-824.)。因此，寻求防治肠粘连的有效药物已成为当今世界外科领域研宄的热 点。目前的研宄表明，羧甲基壳聚糖以其优越的生物相容性已应用于预防术后粘连，但因原 料和制备工艺繁杂等问题所制成的抗粘连材料价格昂贵，因此，制备价廉质优的抗粘连材 料是目前所面临的一个非常紧迫的课题。
[0003] 我国是世界上最大的蚕丝生产国，每年干蛹产量可达10万余吨，蚕蛹价格低廉且 容易获得，甚至蛹衣是家蚕制种过程中的废弃物。并且，蚕蛹壳聚糖还具有某些比虾、蟹壳 聚糖更优良的性能，比如蚕蛹壳聚糖在稀酸中的溶解性好于虾、蟹(参见文献：熊燕飞，天 然产物研宄与开发.1998, 10(1) :82-86)。可见蚕蛹更适合制备医药级壳聚糖，满足医药级 壳聚糖脱乙酰度高，纯度高的要求。所以，未来有希望利用蚕蛹或蛹衣生产壳聚糖，并且开 发一系列抗粘连广品。
[0004] 从经济、环保等方面进行考虑，以蚕蛹为原料开发抗粘连材料是将来对蚕蛹综合 利用的一个不错的选择。以育种和缫丝后的废料为原料开发的抗粘连剂能高效地对丝绸工 业的副产物进行充分利用或高附加值医用生物材料的开发。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有的医用抗粘连剂存在的不足，提供一种价廉质优的蚕蛹羧甲基壳 聚糖及其制备方法，将其用作为抗粘连材料，能有效地预防术后的肠粘连。
[0006] 实现本发明目的的技术方案是提供一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，蚕蛹皮经 脱蛋白、脱盐和脱色处理后制成蚕蛹甲壳素，再进行如下步骤的加工： 1、 将蚕蛹甲壳素粉末置于按质量体积比浓度为30~50%的NaOH溶液中浸润；在温度 为-30~-10°C的条件下冷冻处理10~30h，再在温度为30~60°C的恒温水浴条件下解 冻处理1~5h; 2、 重复步骤1，对蚕蛹甲壳素粉末进行1~4次的冻融处理； 3、 按质量体积比浓度为3~5%，用蒸馏水稀释蚕蛹甲壳素溶液，离心收集上清液； 4、 将得到的上清液在冰水浴中用稀盐酸溶液中和至中性，加入预冷温度为 5°C~-10°C的乙醇，按体积比，乙醇的浓度为60~80% ;过滤收集沉淀物，再经乙醇洗涤，无 水乙醇脱水，真空干燥后，得到蚕蛹羧甲基壳聚糖。
[0007] 本发明所述的蚕蛹皮的制备方法为：将蚕茧经丝棉片加工或缫丝加工后所得到的 副产物缫丝蛹，经压榨、洗涤处理，去除蚕蛹内容物后，再经过滤，滤物烘干后，得到蚕蛹皮。 所述的蚕蛹皮的脱蛋白处理方法，将蚕蛹皮置于按质量体积比浓度为6~8%的NaOH溶液 中，在温度为90~100°C的条件下处理1~2h。所述的蚕蛹皮的脱盐处理方法，将蚕蛹皮 置于按质量体积比浓度为4~6%的HC1溶液中，在温度为50~80°C的条件处理1~3h。 所述的脱色处理方法，将蚕蛹皮置于按质量体积比浓度为20~40%的H202中煮沸处理4~ 10min〇
[0008] 本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种水溶性的蚕蛹羧甲基壳聚糖。 本发明提供的蚕蛹羧甲基壳聚糖还可用作为预防手术肠粘连的防粘连剂。所述的防粘连剂 包括凝胶剂或喷雾剂。
[0009] 与现有技术相比，本发明的突出效果在于：提供的合成蚕蛹羧甲基壳聚糖技术，并 用作为抗粘连剂，具有优越的生物相容性及抗粘连活性。同时，本发明以蚕蛹为原料，合成 的蚕蛹羧甲基壳聚糖抗粘连剂，不仅有效解决了丝绸及蚕桑育种产业的副产物蚕蛹的高附 加值利用问题，而且为开发价廉质优的抗粘连材料可能提供了新的途径。
【附图说明】
[0010] 图1是本发明实施例提供的虾蟹壳及蚕蛹来源的甲壳素、壳聚糖和羧甲基壳聚糖 样品的红外光谱对比图； 图2是本发明实施例提供的虾蟹壳及蚕蛹来源的甲壳素、壳聚糖和羧甲基壳聚糖样品 的热失重分析对比结果图； 图3是本发明实施例提供的蚕蛹羧甲基壳聚糖不同浓度剂量组与空白对照组作实验， 得到的对小鼠L929细胞其形态及数量变化结果图； 图4是在本发明实施例提供的不同浓度剂量的蚕蛹羧甲基壳聚糖中，小鼠L929成纤维 细胞生长的结果对比图； 图5是发明实施例提供的蚕蛹羧甲基壳聚糖用作抗粘连材料的动物实验结果照片图。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1 : 缫丝蚕蛹经过电动压榨机(如甘蔗榨汁机）反复压榨三次后，用清水反复清洗，去除蚕 蛹内容物，剩余的蛹皮烘干备用；而育种后的废蛹衣用清水冲洗干净后直接烘干备用。
[0012] 将收集得到的蛹皮和蛹衣中提取甲壳素的步骤为：脱蛋白方法为7%Na0H，90~ 100°C下反应1~2h;脱无机盐方法为：5%HC1，50~80°C下处理1~3h;脱色方法为： 30%H202煮沸脱色4~10min。处理完成后至于60°C烘箱内加热烘干，样品用粉碎机反复 粉碎制成蚕蛹甲壳素粉末。
[0013] 称取一定量的蚕蛹甲壳素粉末样品，置于40%NaOH(W/V)中浸润过夜；接着置 于-20°C保温10~30h，取出后40°C恒温水浴解冻3h，如此反复冻融处理4次。处理结 束用蒸馏水稀释至甲壳素终浓度为3~5%。溶液离心收集上清液，上清液在冰水浴中用稀 盐酸溶液小心中和至中性，然后倾入一定量预冷的乙醇，使乙醇的终浓度为70%，过滤收集 沉淀，反复用70%乙醇洗涤，再用无水乙醇脱水，真空干燥，得到水溶性蚕蛹壳聚糖。
[0014] 称取10g蚕蛹壳聚糖粉末，通过以下步骤进行羧化反应： 1、溶胀：蚕蛹壳聚糖于烧瓶中，加入乙醇浸泡数小时。
[0015] 2、碱化：向反应器中加入一定量50%NaOH(W/V)，搅拌均匀后浸泡3h，得碱化壳 聚糖。
[0016] 3、羧甲基化：称取一定量氯乙酸，在搅拌状态下分数次加入到碱化壳聚糖中，边加 氯乙酸边用pH计测定，pH不低于9,反应温度不超过80 °C，反应5h，制得粗产品。
[0017] 4、终止：反应结束后，用醋酸调节pH至中性，离心弃去不溶物，上清液中加入无水 乙醇静置，用纱布过滤，过滤物用乙醇分别洗涤数次，烘干即得蚕蛹羧甲基壳聚糖。
[0018] 实施例2 : 将实施例1得到的蚕蛹壳聚糖与来源于虾蟹壳的壳聚糖用紫外光谱法测定脱乙酰度， 并用滤纸称重法测定其在2%醋酸中的溶解性。具体结果参见表1。实施例1中所得的蚕 蛹羧甲基壳聚糖与虾蟹壳来源的羧甲基壳聚糖用电位滴定的方法检测取代度，结果参见表 2〇
[0019] 表1不同壳聚糖脱乙酰度及溶解性
【主权项】
1. 一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，蚕蛹皮经脱蛋白、脱盐和脱色处理后制成蚕蛹 甲壳素，其特征在于再进行如下步骤的加工： (1) 将蚕蛹甲壳素粉末置于按质量体积比浓度为30~50%的NaOH溶液中浸润；在温 度为-30~-10°C的条件下冷冻处理10~30h，再在温度为30~60°C的恒温水浴条件下 解冻处理1~5h; (2) 重复步骤（1)的冻融处理1~4次； (3) 按质量体积比浓度为3~5%，用蒸馏水稀释蚕蛹甲壳素溶液，离心收集上清液； (4) 将得到的上清液在冰水浴中用稀盐酸溶液中和至中性，加入预冷温度为 5°C~-KTC的乙醇，按体积比，乙醇的浓度为60~80% ;过滤收集沉淀物，再经乙醇洗涤，无 水乙醇脱水，真空干燥后，得到蚕蛹羧甲基壳聚糖。
2. 根据权利要求1所述的一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于：所述的蚕 蛹皮的制备方法为：将蚕茧经丝棉片加工或缫丝加工后所得到的副产物缫丝蛹，经压榨、洗 涤处理，去除蚕蛹内容物后，再经过滤，滤物烘干后，得到蚕蛹皮。
3. 根据权利要求1所述的一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于：所述的蚕 蛹皮的脱蛋白处理方法，将蚕蛹皮置于按质量体积比浓度为6~8%的NaOH溶液中，在温度 为90~100°C的条件下处理1~2h。
4. 根据权利要求1所述的一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于：所述的蚕 蛹皮的脱盐处理方法，将蚕蛹皮置于按质量体积比浓度为4~6%的HCl溶液中，在温度为 50~80°C的条件处理1~3h。
5. 根据权利要求1所述的一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的制备方法，其特征在于：所述的脱 色处理方法，将蚕蛹皮置于按质量体积比浓度为20~40%的H2O2中煮沸处理4~10min。
6. 按权利要求1制备方法得到的一种水溶性的蚕蛹羧甲基壳聚糖。
7. -种如权利要求6所述的蚕蛹羧甲基壳聚糖的应用，其特征在于：将所述的蚕蛹羧 甲基壳聚糖用作为预防手术肠粘连的防粘连剂。
8. 根据权利要求7所述的一种蚕蛹羧甲基壳聚糖的应用，其特征在于：所述的防粘连 剂包括凝胶剂或喷雾剂。
【专利摘要】本发明公开了一种蚕蛹羧甲基壳聚糖、制备方法及其应用。将缫丝蚕蛹或蛹衣样品经过脱蛋白、脱盐和脱色处理得到蚕蛹甲壳素样品，在碱性条件通过反复冻融的处理方法获得水溶性的蚕蛹壳聚糖，经羧化反应制成蚕蛹羧甲基壳聚糖。本发明摒弃了高温浓碱的脱乙酰处理方法，减少环境污染；并利用缫丝蚕蛹或制种废弃物蛹衣为原料，从而降低了成本。将本发明提供的蚕蛹羧甲基壳聚糖用作防粘连剂，经动物体内和体外实验表明，能有效抑制成纤维细胞的生长，预防术后大鼠肠粘连。本发明提供了一种预防术后粘连的新材料。
【IPC分类】A61P41-00, C08B37-08, A61K31-722
【公开号】CN104817649
【申请号】CN201510238739
【发明人】张雨青, 朱琳
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月12日