一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术领域，涉及一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法。
【背景技术】
[0002]高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，它伴有心脏、血管、脑和肾等器官器质性病变，是导致中风、冠心病的危险致病因子，在我国其发病率在成年人中高达20%，已经成为生命“第一杀手”，防治高血压成为全球医务界的一项艰巨任务。高血压的病因复杂，已知体内许多系统与血压调节有密切关系，其中最重要的是升压系统一肾素-血管紧张素系统(Renin-Ang1tensin System, RAS)和降压系统一激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-Kinin System, KKS)。系统中存在的血管紧张素转化酶是影响RAS和KKS的关键酶。在RAS中，血管紧张素转化酶水解无升压活性的血管紧张素I，生成具有升压活性的血管紧张素II。而在KKS中，血管紧张素转化酶能够降解具有降压活性的缓激肽，使之失去降血压活性。血管紧张素转化酶通过以上两种途径参与了体内血压调节，造成血压的升高，引发高血压。近年来，具有抑制血管紧张素转化酶作用的生物活性肽的研宄呈明显上升趋势，人们已经从很多生物资源中分离得到血管紧张素转化酶抑制肽，来源于食物中的血管紧张素转化酶抑制肽具有降压活性显著、没有毒副作用、安全性高、成本低、易吸收等特点，而常规的降血压药都有明显的副作用，在高血压已成为危及人类身体健康的主要疾病的今天，食物中血管紧张素转化酶抑制肽更加符合人们的需求。目前从食物蛋白质中通过酶技术等现代生物技术获得血管紧张素转化酶抑制活性肽为高效安全的抗高血压药的研宄提供了丰富的依据。
[0003]海蜇作为一种药食同源的大型水母，在我国有广阔的资源分布和悠久的应用历史，早在一千六百多年前就已经开始为世人所食用。海蜇除食用外，全身均可入药，祖国医学认为其性味咸平，入肺、肝两经，有润肺、化痰、止咳、清热、消食、润肠等功效。据李时珍《本草纲目》所述，海蜇“气味咸温无毒、主治妇，入劳损、积血带下，小儿风疾丹毒，烫火伤”等，对气管炎、哮喘、高血压、胃溃疡、单纯性甲状腺肿大等症均有疗效。近年来我国医卫部门关于海蜇的药用价值也有许多报道。认为对治疗高血压、慢性气管炎、哮喘、热痰咳嗽、胃溃疡，单纯性甲状腺肿和颈淋巴结肿等，有一定疗效。尤其是海蜇的降压作用比较显著，药理研宄证明:海蜇蛋白酶解产物对肾动脉狭窄高血压模型动物具有明显的降压作用。海蜇主要是由水，蛋白质、灰分、碳水化合物、脂肪等物质组成。近代研宄分析表明:每10g海蜇食部中，含水分65.0g，灰分18.7g，蛋白质12.3g，碳水化合物3.9g，脂肪0.lg，钙182mg，铁9.5mg，硫胺素0.0lmg，核黄素0.04mg，尼克酸0.2mg，胆固醇16mg。海蜇的许多药理活性都与蛋白质有关，由此推测海蜇降压的主要原因可能是通过所含有的活性肽抑制血管紧张素转化酶活性而发挥作用的。因此海蜇是酶解分离血管紧张素转化酶抑制肽的优质资源。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的是提供一种从海蜇中制备的血管紧张素转化酶抑制肽，以提供一种新的食物来源的血管紧张素转化酶抑制肽。
[0005]该从海蜇中制备的血管紧张素转化酶抑制肽具有10个氨基酸，其序列为Gly-P1-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala,具有较高的血管紧张素转化酶抑制活性。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种从海蜇中制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法。
[0007]本发明通过以下技术方案实现上述发明目的，所述从海蜇中制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，包括
[0008]I)海蜇蛋白酶解产物的制备:海蜇用酸性蛋白酶水解后，收集相对分子质量小于3000Da的组分，脱盐，得到海蜇蛋白酶解产物；
[0009]2)血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化:所述海蜇蛋白酶解产物首先经SPSephadex C-25阳离子交换柱分离，收集具有抑制血管紧张素转化酶活性的组分，该活性组分再经Sephadex G_25凝胶柱和反相高效液相色谱纯化。
[0010]SP Sephadex C-25阳离子交换柱洗脱条件为:洗脱液为20mM醋酸缓冲液，pH4.0，洗脱速度为0.6mL/min。
[0011]Sephadex G_25凝胶柱分离条件为:洗脱液为双蒸水，洗脱速度为0.6mL/min。
[0012]SP Sephadex C-25阳离子交换柱和Sephadex G-25凝胶柱的洗脱液的检测波长均为280nm ;高效液相色谱的检测波长为220nm。
[0013]本发明的优点是:1.所制备的血管紧张素转化酶抑制肽来源于食物，安全无毒，对血压正常的人没有作用，同时经过体内酶解，有利于消化吸收，降血压作用显著；2.采用酶膜耦联技术分离该血管紧张素转化酶抑制肽方法简单，工序步骤少。
【附图说明】
[0014]图1S^hadex C-25 洗脱曲线
[0015]图2Sephadex G-25 洗脱曲线
[0016]图32-2组分高效液相分析图谱(检测波长220nm)
[0017]图4Pji分高效液相色谱分析(检测波长220nm)
【具体实施方式】
[0018]1.血管紧张素转化酶抑制活性的测定
[0019]将Cushman-Cheung(1971)方法略作修改。原理是:在37°C、pH 8.3条件下，血管紧张素转化酶催化水解血管紧张素I (Ang I )模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)产生马尿酸(Hip)。马尿酸在紫外228nm处具有特征吸收峰，通过生成物马尿酸的变化计算血管紧张素转化酶抑制率。具体操作如下:用1.5mL离心管，空白对照组加入10yL 5mmol/LHHL,用pH 8.3硼酸缓冲液补足至120 μ L，37°C恒温水浴保温5min，加入5 μ L 0.lU/mL血管紧张素转化酶启动反应；样品组加入100 μ L 5mmol/L HHL和20 μ L水解液后，37°C恒温水浴保温5min，加入5μL 0.lU/mL血管紧张素转化酶启动反应，之后两组均在37°C恒温保持30min后，加入lmol/L HCl 200 μ L中止反应，再加入1.5ml冷的乙酸乙酯，振摇15s，4000r/min离心1min后取出1.0mL乙酸乙酯层转入另一离心管中，置于95°C烘箱中烘干，再用ImL去离子水溶解后，在228nm处测定吸光值。
[0020]ACE抑制活性按照下式计算:
[0021]ACE 抑制率(% ) = [ (A0-As) /A0] X 100%
[0022]其中，Atl为不存在抑制剂时的吸光值;A 3为存在样品与酶时的吸光值。
[0023]用IC5tl表示抑制率为50%时ACE活性所需的抑制剂的浓度。
[0024]2.海蜇蛋白酶解产物的制备
[0025]将三矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5?6小时，用清水洗涤后，重复上述操作三次，沥干后加10倍量水打浆，以海蜇蛋白含量计，先加入2%胃蛋白酶，调整pH至3.0，37°C水解4h后，再加入6 %木瓜蛋白酶，调整pH至5.0，50°C水解Ih，100°C加热lOmin，灭酶后，4000转/分离心15min，取上清液。
[0026]采用分子量为3000Da的超滤膜将酶解液过滤，收集超滤分子量小于3000Da的部分，再进行纳滤处理脱盐，得海蜇蛋白酶解液。纳滤条件:分子量为150?300截留膜，进膜压力llBar，出膜压力llBar。将海蜇蛋白酶解液冷冻干燥，冷冻干燥条件:温度O?50min，0°C升至 20°C ;50 ?300min，20°C ；300 ?350min，20°C升至 40°C ；350 ?750min，40°C ；750 ?800min，40 °C降至20 °C ;真空度为40pa，温度-30 °C，得到海蜇蛋白酶解产物。
[0027]3.血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化
[0028](I)Sephadex C-25阳离子交换柱分离纯化
[0029]上述海蜇蛋白酶解产物经Sephadex C_25凝胶柱分离后，可得到3个峰。如图1所示。组分1，2和3的血管紧张素转化酶抑制率分别为IC5tl= 2.62mg/ml, 2.87mg/ml和0.65mg/mlo将活性最高的组分3收集冻干后备用。
[0030](2) Sephadex G-25 分离纯化
[0031]组分3经过S印hadex G_25进一步分离纯化，可以得到2个主要峰。如图2所示。组分3-1和3-2的血管紧张素转化酶抑制率分别为IC5tl= 1.97mg/ml和0.16mg/ml?将活性较高组分3-2收集冻干待后续分离。
[0032](3)高效液相色谱分析
[0033]样品3-2经过高效液相进一步分离纯化如图3，收集活性肽Pl(保留时间为25.17min)。收集色谱峰后，对其进行了纯度的检测，由图4可知，分离纯化血管紧张素转化酶抑制肽纯度较高，血管紧张素转化酶抑制活性IC5tl为26.34±2.39 μ g/mL。可以进行后续的氨基酸序列分析。
[0034]4.氨基酸序列分析
[0035]利用埃德曼降解法(Edman降解法)，对所制备的活性肽段Pl进行了氨基酸序列分析，其结构序列为 Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala。
【主权项】
1.一种从海蜇中制备的血管紧张素转化酶抑制肽，其特征是:其氨基酸序列为Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Alaο
2.—种从海蜇中制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法，包括 1)海蜇蛋白酶解产物的制备:海蜇用酸性蛋白酶水解后，收集相对分子质量小于3000Da的组分，脱盐，得到海蜇蛋白酶解产物； 2)血管紧张素转化酶抑制肽的分离纯化:所述海蜇蛋白酶解产物首先经SPSephadexC-25阳离子交换柱分离，再经S印hadex G_25凝胶柱和反相高效液相色谱纯化，收集具有抑制血管紧张素转化酶活性的组分， SP Sephadex C-25阳离子交换柱洗脱液为醋酸缓冲液，Sephadex G-25凝胶柱洗脱液为双蒸水。
【专利摘要】本发明公开了一种血管紧张素转化酶抑制肽及其制备方法，血管紧张素转化酶抑制肽的氨基酸序列为Gly-Pro-Gly-Ala-Ala-Gly-Asp-Asp-Gly-Ala。本发明所制备的血管紧张素转化酶抑制肽来源于食物，安全无毒，对血压正常的人没有作用，同时经过体内酶解，有利于消化吸收，降血压作用显著；采用酶膜耦联技术分离该血管紧张素转化酶抑制肽方法简单，工序步骤少。
【IPC分类】C07K1-16, C12P21-06, A61P9-12, C07K1-20, C07K1-18, C07K7-06
【公开号】CN104829689
【申请号】CN201510217366
【发明人】孙振亮, 冯景
【申请人】上海市奉贤区中心医院
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月30日