一种白细胞介素-6单克隆抗体的制备方法
【专利说明】
(一)技术领域:
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种白细胞介素-6单克隆抗体的制备方法。
(二)【背景技术】:
[0002]皮炎是皮肤的常见病多发病，在世界各国人群中的发病率约为2_5 % ο其发病的细胞和分子机理已在近几年中得到阐明。它是由于机体内在的遗传和外界的环境等综合因素引起的炎症性疾病。表皮角质化细胞在各种因素刺激下可诱导和产生多种细胞因子，特别是白细胞介素-6(IL-6)，IL-6是一种强烈的嗜中性白细胞化学趋向因子，能强力地募集和激活嗜中性白细胞。在外源或内源性的刺激下，多种细胞(包括单核细胞，巨噬细胞，T淋巴细胞，嗜中性粒细胞，成纤维细胞，角质化细胞等)会分泌过量的白细胞介素_6，使IL-6在皮肤局部的浓度高于正常水平。IL-6就会和携带IL-6受体的细胞表面受体结合，激活这些细胞，引起过度地增生。同时，被激活的细胞又大量分泌IL-6，募集全身的嗜中性细胞汇集到皮肤病灶部位，浸润和损伤正常皮肤，形成恶性循环，导致难以医治的种皮肤炎症性疾病。
[0003]应用具有高特异性和中和活性的抗IL-6抗体，可以有效地中和及消除表皮中过量的IL-6，从而阻断或减少嗜中性白细胞的募集和浸润，阻断炎症反应的恶性循环，达到治疗炎症皮肤病灶，使表皮得以恢复正常的效果。
(三)
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的在于提供一种制备白细胞介素-6的单克隆抗体的制备方法，它针对上述情况，发明一种操作简便、成本低廉、高效的制备方法。
[0005]本发明的技术方案:一种制备白细胞介素-6的单克隆抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤:
[0006](I)收集大量炎性细胞样本及正常细胞样本，并通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析在皮炎细胞中特异表达的白细胞介素-6，对这些蛋白进行分离纯化；
[0007](2)完成白细胞介素-6单克隆抗体的表达和纯化；
[0008]1、用分离纯化出来的白细胞介素-6进行动物免疫。选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。按照每只鼠10ug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1: 10000以上，可以在融合前三天加强免疫，100 μ L的PBS溶解50ug白细胞介素-6腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
[0009]2、细胞融合和筛选。为了产生分泌治疗白细胞介素-6细胞因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在10: I的比例混合。将细胞的混合物用无血清MDM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50% PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的MDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200ul/well接种于96孔细胞培养板中。之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌针对白细胞介素-6的抗体阳性细胞孔。首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌白细胞介素-6抗体的杂交瘤细胞株。
[0010]3、腹水制备:选择6-8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7_10天后注射杂交瘤细胞。注射细胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高的白细胞介素-6的单克隆抗体。
(四)【具体实施方式】:
[0011]以下将通过【具体实施方式】的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的【具体实施方式】，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0012]实施例1:白细胞介素-6的获得
[0013]通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法分析200多个炎性细胞样本与200多个正常细胞样本，找出白细胞介素_6，分离纯化出它；
[0014]实施例2:白细胞介素-6单克隆抗体的表达
[0015]1、用分离纯化出来的细胞因子进行动物免疫。
[0016]选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。按照每只鼠10ug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。免疫7-10天后小鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1:1w以上，可以在融合前三天加强免疫，100 μ L的PBS溶解50ug白细胞介素-6腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
[0017]2、细胞融合和筛选。
[0018]为了产生白细胞介素-6的单克隆抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在10: I的比例混合。将细胞的混合物用无血清MDM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50% PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的MDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200ul/well接种于96孔细胞培养板中。之后，每隔2_3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌针对白细胞介素-6的抗体阳性细胞孔。首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在100%，获得可以稳定分泌白细胞介素-6抗体的杂交瘤细胞株。
[0019]实施例3:白细胞介素-6的单克隆抗体的纯化
[0020]选择6-8周龄的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml石錯油，7_10天后注射杂交瘤细胞。注射细胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高白细胞介素-6的单克隆抗体。
【主权项】
1.一种白细胞介素-6单克隆抗体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤:(I)细胞因子白细胞介素-6的分离纯化；(2)白细胞介素-6的单克隆抗体的表达；(3)白细胞介素-6单克隆抗体的纯化。
2.根据权利要求1所述的一种制备白细胞介素-6单克隆抗体的方法，其特征在于通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法找出在炎性细胞中特异表达的白细胞介素-6。
3.根据权利要求1所述的一种制备白细胞介素-6单克隆抗体的方法，其特征在于，用在炎性细胞中特异表达的白细胞介素-6对小鼠进行免疫，如果抗体滴度在I: 8000-1: 12000以上时，可将免疫小鼠脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选。
4.根据权利要求1所述的一种制备白细胞介素-6单克隆抗体的制备方法，其特征在于向小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后8-12天收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得白细胞介素-6的单克隆抗体。
【专利摘要】本发明涉及的是一种制备白细胞介素-6单克隆抗体的方法，其特征在于，通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析在炎性细胞中特异表达的细胞因子，对这些蛋白进行分离纯化；用分离纯化出来的炎性细胞中特异表达的细胞因子对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫，如果抗体滴度在1∶10000以上时，可将免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，得到分泌白细胞介素-6的单克隆抗体的杂交瘤细胞；向6-8周龄的BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后10天左右收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高的白细胞介素-6的单克隆抗体。
【IPC分类】C07K16-24
【公开号】CN104829717
【申请号】CN201510218440
【发明人】李凤娟, 张释元, 刘洋, 候依萍, 黄雪雪, 蒋坤
【申请人】天津工业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月28日