草鱼呼肠孤病毒s7基因突变株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及草鱼呼肠孤病毒，具体地说，涉及一种草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 病毒性草鱼出血病一直制约我国草鱼养殖业的健康发展，具有发病急、感染性强、 传播速度快、流行范围广、治疗困难、死亡率高等特点。农业部公告第1125号发布的《一、 二、三类动物疫病病种名录》（2008)，在防疫名录中水生动物疫病种类有36种，其中草鱼出 血病被列为二类疫病。草鱼呼肠孤病毒（Grasscarpreovirus，GCRV)是草鱼出血病的致 病病原。
[0003]GCRV主要由核酸基因组和蛋白质衣壳组成。同其它无囊膜病毒一样，其基因组为 病毒增殖和遗传变异提供遗传信息，衣壳则保护核酸免受外界因素影响和破坏，并可介导 病毒核酸进入细胞内部。GCRV病毒粒子为20面体对称的球形颗粒，在形态和基因组结构上 与哺乳动物呼肠孤病毒（Ma_alianreovirus，MRV)具有相似之处，但二者编码蛋白质的氨 基酸序列的同源性小于20%。GCRV的基因组由11条分节段双链RNA构成，编码的12个蛋 白质中含7个结构蛋白和5个非结构蛋白。
[0004] 研宄GCRV基因组结构与功能的关系对于了解GCRV的致病机理以进一步防治草鱼 出血病具有重要的意义，而突变株是比较性的研宄基因功能的有力工具。目前GeneBank全 基因组收录的GCRV毒株主要有GCRV-873、GCRV-104、GCRV-GD108、GCRV-HZ08 和AGCRV毒 株，但是发现更多的突变株仍然是十分必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种草鱼呼肠孤病毒S7基因突变 株。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供所述的草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株的用途。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0008] 一种草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株，所述的草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株的保 藏号为CCTCCNO:V201515。
[0009] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0010] 如上所述的草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株的用途，所述的用途选自：
[0011]a)用于研宄草鱼呼肠孤病毒基因或蛋白的功能；
[0012] b)比较性地研宄同一种草鱼呼肠孤病毒不同突变型；或
[0013] c)用于建立草鱼出血病动物模型。
[0014] 本发明优点在于：
[0015] 本发明分离纯化得到一株草鱼呼肠孤病毒突变株，于2015年3月27日保藏于中 国典型培养物保藏中心（中国武汉大学，430072)，保藏编号为CCTCCN0:V201515,培养物 名称：草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株GCRV-JX02-S7SD。研宄发现该病毒株感染CIK细胞 后不产生明显的细胞病变效应，并能在CIK细胞中复制扩增，序列分析表明该病毒株相比 于GCRV-HZ08株S7基因（⑶350744)在GCRV-HZ08株S7基因583bp至1008bp处出现基因 缺失，缺失片段为426bp，并且S2中间也出现3个碱基的缺失引起一小段编码的氨基酸序列 变异。本发明的草鱼呼肠孤病毒突变株为比较性地研宄同一种草鱼呼肠孤病毒不同突变型 提供了生物学材料，提示VP56蛋白质在该基因型病毒感染扩增过程中不是必需的蛋白质， 有助于进一步研宄草鱼呼肠孤病毒的增殖和感染机制，以有效防治草鱼出血病。
【附图说明】
[0016] 图1.草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株GCRV-JX02-S7SD感染CIK细胞的显微镜照 片。
[0017] 图2.草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株GCRV-JX02-S7SD的S1~S9片段的PCR检 测。M.DL2000分子量标准。
[0018] 图3.草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株GCRV-JX02-S7SD S7CDS框与GCRV-HZ08S7 序列比对图。
[0019] 图4.草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株GCRV-JX02-S7SD S2与GCRV-HZ08S2片段部 分核苷酸序列以及编码的氨基酸序列的比对图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0021] 本发明从江西草鱼养殖场疑似草鱼出血病病鱼体分离一株病毒，在CIK细胞系中 进行无限稀释法传代分离纯化病毒，盲传80代后进行梯度离心，超速离心后收集病毒进行 序列分析。该病毒已于2015年3月27日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉大 学，430072)，保藏编号为CCTCCNO:V201515,培养物名称：草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株 GCRV-JX02-S7SD。
[0022] 1材料和方法
[0023] 1. 1仪器和设备
[0024] 台式高速冷冻离心机：力康生物医疗科技控股有限公司；
[0025] 漩涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；
[0026] 2-KTC冷藏箱：Haier;
[0027] 低温保存箱：Haier;
[0028] 净化工作台：上海博讯实业有限公司
[0029]电泳仪：Tanon;
[0030] 基因研宄型纯水仪：艾科浦；
[0031]微波炉：Galanza ;
[0032] 细胞恒温恒湿培养箱：上海安亭科技仪器有限公司；
[0033] NAN0DR0P2000：ThermoScientific；
[0034]GelImageSystem：Tanon；
[0035]TIOOThermal Cycler：BI〇-RAD；
[0036] 1X71倒置式研宄型显微镜OLYMPUS。
[0037] 1. 2材料和试剂
[0038] 草鱼肾细胞（CIK)由本实验室保存并传代；草鱼呼肠孤病毒于2011年8月采自江 西地区疑似草鱼出血病发病鱼塘，症状突出表现为鳍基、鳃盖、眼眶明显充血，局部皮肤块 状充血，带回实验室在CIK细胞系中进行无限稀释法传代分离纯化病毒，-80°C保存。
[0039]Mediuml99培养液、胎牛血清购自杭州四季青公司；TrizolReagent购自 Invitrogen;引物均由上海生工合成；DL2000DNAMarker、PrimerScripit逆转录试剂盒、 PyrobestTMDNAPolymerase购自TaKaRa，其余试剂（琼脂糖）均购自上海生工公司。
[0040] 1.3所用软件
[0041] NCBIBlast在线比对软件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，DNAssist序列 分析软件，引物设计软件PrimerPremier5.0。
[0042] 1. 4实验方法
[0043] 1. 4. 1CIK细胞的传代培养
[0044] 倒置显微镜下观察到CIK细胞长成致密单层即可进行传代。对净化工作台紫外消 毒后，吸出原有培养液，加入适量Medium199培养液清洗并吸出细胞碎片。按每25cm2细 胞培养瓶加入lml0. 25%Trypsin&O. 02%EDTA，显微镜下观察，细胞呈收缩状变圆并出现 细小空隙，吸出胰酶，加入5ml含有10%胎牛血清的M199培养液中和，吹打至分散均匀。将 细胞悬液分装至培养瓶，置28°C培养箱中培养。
[0045] 1. 4. 2GCRV的增殖
[0046] 培养CIK细胞至汇合单层，吸出培养液，加入1ml培养液清洗细胞碎片后吸出。加 入lml分尚好的病毒液，28°C培养箱中培养lh，使病毒吸附细胞。弃去病毒液，加入5ml含 有2%胎牛血清的M199培养液，置28°C培养箱中培养24小时，收集上清。反复冻融3次， 8000rpm离心 30min，_20°C保存上清。
[0047] 1. 4. 3病毒基因组（dsRNA)的提取
[0048] (1)病毒基因组dsRNA的提取参考Attoui(AttouiH.，BilloirF.，Cantaloube J.F.etal.StrategiesforthesequencedeterminationofviraldsRNAgenomes. JournalofVirologicalMethods, 2000,89:147-158.)和Maan(MaanS，Rao S.J. ,AttouiH.etal.RapidcDNAsynthesisandsequencingtechniquesforthe geneticstudyofbluetongueandotherdsRNAviruses.JournalofVirological Methods, 2007, 143:132-139.)。吸出培养液，加入lmlTRIzol?Reagent，室温放置 5min， 用枪头将CIK细胞刮下，移至1.5mlEP管；
[0049] (2)每lmlTRIzol加入0? 2ml三氯甲烷，剧烈摇晃15s后室温静置5min;
[0050] (3)4°C，12000rpm，离心15min，吸取上层透明液相并移入新管中，体积大约为 0.5ml;
[0051] (4)加入等体积异丙醇（0. 5ml)，混合均匀，室温放置10min;
[0052](5) 4°C，12000rpm，离心 15min;
[0053] (6)弃去上清，加入lmlDEPC水配制的75 %的乙醇清洗RNA沉淀；
[0054](7) 4°C，12000rpm，离心10min，弃去上清液，放于净化工作台或真空干燥 5-10min；
[0055] (8)用适量的RNase-free Water溶解RNA沉淀，测定其浓度。
[0056] 1. 4. 4基因组全长cDNA的合成
[0057] (1)模板RNA (dsRNA连接产物）5 u g，Random 6mers (50 u m) 1 u 1，用RNase free ddH20将体系补充至lOy l，65°C，5min ;
[0058] (2)迅速冰上冷却5min，离心数秒，使液体集中于管底；
[0059] (3)向上述溶液中加入5XPrimerScripit Buffer 4 y 1，dNTP Mixture(各 lOmM) 1 y 1，RNase Inhibitor (40U/ y 1)0. 5 y 1, PrimerScripit Transcriptase lyl，混 匀；
[0060] (4)反应条件：30°〇，101^11;42°〇，111;95°〇，5111111。测定其浓度。1.4.5双引物？〇? 扩增
[0061] 根据GenBank上提交的GCRV-HZ08的S1~S9基因序列，运用软件PrimerPremier 5. 0分别设计扩增每个基因0RF框的引物，对于部分较长基因（Sl，S2,S3,S5)采取分段扩 增后拼接的办法。
[0062] 表1引物序列
[0063]
【主权项】
1. 一种草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株，其特征在于，所述的草鱼呼肠孤病毒S7基因突 变株的保藏号为CCTCC NO !V201515。
2. 权利要求1所述的草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株的用途，其特征在于，所述的用途 选自： a) 用于研宄草鱼呼肠孤病毒基因或蛋白的功能； b) 比较性地研宄同一种草鱼呼肠孤病毒不同突变型；或 c) 用于建立草鱼出血病动物模型。
【专利摘要】本发明涉及一种草鱼呼肠孤病毒S7基因突变株及其应用，该突变株的保藏号为CCTCC NO：V201515。研究发现该突变株感染CIK细胞后不产生明显的细胞病变效应，并能在CIK细胞中复制扩增，序列分析表明该突变株相比于GCRV-HZ08株S7基因在583bp至1008bp处出现基因缺失，缺失片段为426bp，并且S2中间也出现3个碱基的缺失引起一小段编码的氨基酸序列变异。本发明的突变株为比较性地研究同一种草鱼呼肠孤病毒不同突变型提供了生物学材料，提示VP56蛋白质在该基因型病毒感染扩增过程中不是必需的蛋白质，有助于进一步研究草鱼呼肠孤病毒的增殖和感染机制，以有效防治草鱼出血病。CCTCC NO：V20151520150327
【IPC分类】C12N7-00, C12R1-93, C12Q1-68, A01K67-027, G01N33-68
【公开号】CN104830808
【申请号】CN201510206857
【发明人】王浩, 吕利群, 宗乾坤, 许丹, 喻飞, 鲁建飞, 夏思瑶
【申请人】上海海洋大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月27日