一种用于结核分枝杆菌检测的反向斑点杂交试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于细菌鉴别检测的引物、探针及其试剂盒和使用方法，尤其涉 及一种用于结核分枝杆菌鉴别检测的引物、探针及其试剂盒和使用方法，属于结核分枝杆 菌检测领域。
【背景技术】
[0002] 结核病（tuberculosis)是伴随人类历史最长的疾病之一，也是由单一致病菌引 起死亡数最多的疾病，早在古希腊、古埃及时期就有结核病的记载。德国细菌学家柯赫 (Koch)于1882年发现并证实了结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)是导致结 核病的病原菌。结核分枝杆菌可导致全身各处的感染，其中最为常见的为肺结核。据世界 卫生组织（WHO)统计，全球目前约有860万人罹患结核病，130万人死于结核病。我国作为 全球22个结核病高危险性、高负担国家之一，结核病的发病率以平均每年增加0. 4%的速 度增长，高居各类传染病之首。因此，寻找一种快速准确的结核分枝杆菌检测方法已刻不容 缓。
[0003] 目前，结核分枝杆菌的实验室检测方法主要有细菌学检测、血清学检测以及以分 子生物学检测等。细菌学检测仍不失为诊断结核病的常用方法，其中痰涂片镜检是确诊的 依据，但其阳性率较低；结核分枝杆菌培养仍作为结核病诊断的金标准，但其耗时较长。血 清学方法是结核病诊断的重要辅助手段，但其缺乏敏感性和特异性均高的单体蛋白作为血 清学检测结核病的特异性抗原。聚合酶链反应（PCR)技术因其灵敏度和特异性较好，已成 功用于临床标本的检测，但PCR技术需要的热循环设备价格昂贵，且易出现假阴性，假阳 性，交叉污染等问题，使其应用具有一定的局限性。
[0004] 反向斑点杂交（reversedotblot，RDB)是斑点杂交技术的一种。该技术不同 于传统的杂交方法，而是以膜上固定探针取代了固定待测样本DNA(PCR扩增片段或基因组 DNA)，该技术通过一次反应即可将待检DNA样本中某一基因座位上大部分或全部等位基因 判断出，改变了传统杂交法一次只能判断一个等位基因的模式，将基因扩增与分子杂交两 项技术相结合，可准确、直观的观察结果，操作简便，敏感性高，特异性强，在基因分型、基因 突变检测、病原体的检测等方面有其独特的优势。然而，建立结核分枝杆准确、特异的反向 斑点杂交检测方法需先针对其特有的插入序列IS6110设计特异性引物及探针。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是提供一套用于准确检测结核分枝杆菌的引物及探针，可将结 核分枝杆菌与其他常见病原菌进行鉴别诊断的聚合酶链式-反向斑点杂交反应。
[0006] 所述引物及探针均针对结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110为靶序列，基于反 向斑点杂交技术原理设计合成。引物5'端均以生物素标记，探针5'端均加有10个T尾， 其核苷酸序列为：
[0007]
【主权项】
1. 一种用于结核分枝杆菌检测的反向斑点杂交检测的引物及探针，其特征在于，所述 引物及探针均针对结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110为靶序列，基于反向斑点杂交技 术原理设计合成，可用于结核分枝杆菌检测时的聚合酶链式-反向斑点杂交反应，能准确 鉴别结核分枝杆菌。引物5'端均以生物素标记，探针5'端均加有10个T尾，其核苷酸序 列为：
2. -种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，包括结核分枝杆菌特异性检测 的引物组溶液，固定有结核分枝杆菌特异性探针的尼龙杂交膜，室温杂交液，洗液I，洗液 II，碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，碱性磷酸酶缓冲液，显色底物（NBT/BCIP)，显色缓冲液 和聚合酶链式反应预混合液，其特征在于，所述试剂盒可以进行结核分枝杆菌与其他常见 病原菌的鉴别诊断。 所述的结核分枝杆菌特异性检测的引物组溶液，其特征在于，是由权利要求1所述的 引物IS1'与引物IS2'按照I : 1的比例配制而成的，引物浓度为lOymol/L;所述的固 定有结核分枝杆菌特异性探针的尼龙杂交膜，其特征在于，固定有权利要求1所述的结核 分枝杆菌特异性探针Probe-B-3'，同时设置带生物素标记的核苷酸序列为阳性对照，设置 去离子水为阴性对照，探针的点样浓度70-130 μ mol/L，最优浓度为100 μ mol/L ;点样量为 0. 5 μ L。所述的室温杂交液，其特征在于，包括3mL的20 X SSPE、100 μ L的20 % SDS和5mL 的甲酰胺，并用水补足至20mL。
3. -种如权利要求2所述的用于检测结核分枝杆菌的试剂盒的使用方法，其特征在 于，包括聚合酶链式反应扩增和室温反向斑点杂交两个主要步骤，反向斑点杂交可在室温 下完成。 所述的聚合酶链式反应扩增，其特征在于，其25 μ L的反应体系包括：聚合酶链式反应 预混合液12. 5 μ L，引物组混合液2 μ L，DNA模板1 μ L，去离子水9. 5 μ L，阴性对照中以去 离子水代替 DNA 模板。扩增程序为：94°C，3min ;94°0,3〇8,55°0,3〇8,72°0，111^11，共30个循 环；最后在72°C下延伸5min。 所述的室温反向斑点杂交方法，其特征在于，使用如权利要求2所述的室温杂交液进 行杂交，具体步骤为： (1) 将固定有结核分枝杆菌特异性探针的尼龙杂交膜置于杂交管内，加入ImL杂交液； (2) 带有生物素标记的扩增产物于95°C变性lOmin，迅速冰浴IOmin ; (3) 向杂交液中加入5 μ L变性扩增产物，120rpm下，室温杂交120min ; (4) 弃去杂交液，用洗液I、洗液II各洗涤2次，每次IOmin ; (5) 弃去洗液，加入1000倍稀释的碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，于室温反应30min ; (6) 弃去酶液，用底物缓冲液洗涤2次，每次IOmin ; (7) 弃去底物缓冲液，加入新配制的底物，避光反应15min ; (8)将底物弃去，用去离子水终止反应，待膜干燥后判定结果，每个样品设置3个平行 试验，至少有2次出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性结果，无斑点的判定为阴性结果。 所述的室温反向斑点杂交方法，其特征在于，探针点样浓度为25-100 μ mol/L，最优浓 度为100 ymol/L;碱性磷酸酶标记的链霉亲和素稀释倍数为1 : 1000-1 : 5000,最优稀 释倍数为1 : 1000 ;室温杂交时间为30min-过夜，最优时间为120min ;酶促反应时间为 15-120min，最优时间为 30min。
4.如权利要求1所述的引物及探针和如权利要求2所述的试剂盒，用于结核分枝杆菌 检测的聚合酶链式反应-反向斑点杂交检测方法包括但不限定于采用微全分析技术，其特 征在于，样品裂解、核酸提取纯化、核酸扩增和检测均集成在微全分析系统上自动完成，该 微全分析系统由微膜片泵（阀）驱动，通过程序控制微膜片泵（阀）的开启与闭合实现微 流体样品的驱动控制。
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌反向斑点杂交检测的引物、探针及其试剂盒和使用方法。所述试剂盒由PCR引物组、固定有结核分枝杆菌特异性探针的尼龙杂交膜及其他反向斑点杂交反应试剂构成。引物组由序列为TACGGTGCCCGCAAAGTG的IS1’引物和序列为AGGCGTCGGTGACAAAGG的IS2’引物构成，探针由序列为GCCTTTGTCACCGACGCCTA的Probe-B-3’探针构成。所述试剂盒的使用方法，其特征在于，可在室温下将结核分枝杆菌与其他常见病原菌鉴别开来，灵敏度高，特异性强，操作简便，对温度要求较低，为结核分枝杆菌的鉴别诊断提供了技术保障。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04, C12N15-11
【公开号】CN104830848
【申请号】CN201510223792
【发明人】邹明强, 薛强, 金福姝, 孙福军, 郭敏卓, 张帆
【申请人】中检国研(北京)科技有限公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月5日