一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因0-型硫氧还蛋白（TRXo)及其应 用，属于植物生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 蓝莓（Vacciniumspp.)作为新兴水果，具有很高的营养价值与经济效益，由于蓝 莓独特的保健作用，在美国和日本等发达国家是最流行的小水果之一，且被国际粮农组织 列为人类五大健康食品之一，堪称"世界第三代水果之王"。蓝莓原产于北方寒冷地区，在亚 热带地区种植蓝莓不但可使其生长期延长，并大大提前了果实成熟期，在国内市场上蓝莓 正处于高价位时期。但由于亚热带地区夏季天气燥热，日照强烈，气温可高达35~39°C，有 时甚至达到40°C以上，对蓝莓造成生长停滞，甚至导致其死亡。高温是限制蓝莓生长和产量 的主要环境因素之一，近年来，温室效应导致全球性气温上升和中国蓝莓产业的南移，对于 耐热蓝莓品种的筛选和耐热新品种的培育显得尤为重要。而常规田间自然鉴定法，虽然具 有操作简便的特点，但该方法需要栽培几年后才能评价，并且只有大面积栽培才能保证结 果的准确性，因此常常需要耗费大量的人力物力，还存在实验周期长等缺点。而通过耐热标 记基因对耐热蓝莓品种筛选具有快捷、方便和准确的优点。最近，浙江师范大学蓝莓课题组 在对高温胁迫条件下蓝莓的生理生化和分子相关指标进行分析时，发现TRXo在不同蓝莓 品种中能够稳定的上调表达，且发现耐热能力越强的蓝莓品种上调量越大，这为开发一种 鉴定蓝莓耐热品种的分子方法提供了一种思路。
[0003] 硫氧还蛋白（TRX)是一类广泛存在于生物体内的多功能酸性蛋白，分子量约 12kDa，参与细胞的一系列生化反应。蛋白质中Cys氧化产物的还原需要TRX和NTR进行， 且活性氧清除体系中的抗氧化酶富含Cys，TRX可使其还原后恢复清除R0S的活性。TRX中 TRXf、m、x、y和z定位于叶绿体，而TRXh不仅存在于细胞质，还存在于内质网和线粒体中， TRXo和NTR则是新近发现的线粒体蛋白。研宄表明Trx具有基本的氧化还原功能之外，还 有许多其他生物学活性，通过参与若干生理过程而发挥重要的生物学功能，包括调节抗氧 化作用、抗胁迫作用、参与细胞凋亡过程和调节转录因子DNA结合活性等。研宄表明TRX在 植物抵抗高温、干旱和低温等非生物胁迫中起到非常重要的作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种在高温胁迫下的不同耐热性蓝 莓品种中上调表达且程度不同的标记基因0-型硫氧还蛋白（TRXo)的序列引物，并利用 该引物进行蓝莓品种是否是耐热品种的鉴定方法，采用实时定量基因扩增荧光检测技术 (qRT-PCR)，对该标记基因在待检测蓝莓品种中的表达量进行检测和分析，进行鉴定待检测 蓝莓品种的耐热性。
[0005] 上述目的通过以下技术方案实现：
[0006] 1.提供一种在高温胁迫条件下的不同蓝莓品种中上调表达且程度不同的标记基 因0-型硫氧还蛋白（TRXo)，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 2.针对上述基因的核苷酸序列，进行qRT-PCR引物的设计，SEQIDNo. 2和SEQID No. 3 (见表 1)。
[0008] 3.人工模拟气候45°C热胁迫处理待检测蓝莓6h，并提取总RNA，逆转录成cDNA作 为模板；以GAPDH为内参基因（SEQIDNo. 4和SEQIDNo. 5,见表1)，进行qRT-PCR鉴定。 若标记基因在待测蓝莓品种叶片中的表达模式为上调表达，且表达量高于5倍及以上，则 表明该蓝莓品种是耐热品种。
[0009] 表1进行qRT-PCR的相关引物
[0010]
[0011] 有益效果：
【主权项】
1. 一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因 O-型硫氧还蛋白，其特征在于，其核苷酸序列 SEQ ID NO. 1。
2. 根据权利要求1所述的一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因〇-型硫氧还蛋白，其特征 在于，其能够在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同。
3. -对鉴定蓝莓耐热品种的标记基因〇-型硫氧还蛋白的qRT-PCR引物，其特征在于， 以其CDS序列为模板，进行qRT-PCR引物的设计，引物序列如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3 所示。
4. 一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因的应用，其特征在于，人工模拟气候45°C热胁迫 处理待检测蓝莓6 h，并提取总RNA，逆转录成cDNA作为模板；以似/??为内参基因，其引物 序列为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,以权利要求3所述序列为引物，进行qRT-PCR鉴定，以 大连宝生物荧光定量试剂盒RR82LR为例： qRT-PCR反应体系如下： SEQ ID No. 2/ SEQ ID No. 4 (10 μM) 0. 4 μ L SEQ ID No. 3/ SEQ ID No. 5 (10 μ Μ) 0. 4 μ L cDNA 模板 1.0 yL SYBRVrefflix Ex Taq II (2Χ) (Tli ENaseH Plus), ROX plus 10 μ L ddH20 8· 2 μ L 反应条件：95°C 30 s; 95°C 5 s，58°C 35 s，总共40个循环，进行qRT-PCR检测，并 使用法进行计算分析。
5. -种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因在蓝莓耐热品种筛选中的应用，其特征在于， 以在适宜温度栽培条件下的蓝莓为对照，45°C高温胁迫6 h的蓝莓为待检测材料，提取 两者叶片总RNA，并反转录得到cDNA，以此为模板，以鉴定蓝莓耐热品种的标记基因特异序 列片段为引物，以似/??为内参基因，进行qRT-PCR检测，并使用2 4 Aet法进行计算分析； 如果鉴定蓝莓耐热品种的标记基因〇-型硫氧还蛋白的表达模式在待检测品种中为上调表 达，且表达倍数大于等于5,则表明该蓝莓品种为耐热品种，说明该蓝莓品种可在亚热带等 地区种植栽培，或育种得到的新品种具有较高的耐热性；证明〇-型硫氧还蛋白基因是一个 可以广泛用于鉴定蓝莓品种耐热性的标记基因。
【专利摘要】本发明涉及一种鉴定蓝莓耐热品种的标记基因及其应用，属于植物生物技术领域。利用该标记基因，即o-型硫氧还蛋白（TRXo），能够在高温胁迫下的不同耐热性蓝莓品种中上调表达且程度不同的特性。以该基因CDS序列为模板设计引物，检测方法：人工模拟气候45℃热胁迫处理蓝莓6 h，并提取总RNA，逆转录成cDNA作为模板，进行qRT-PCR检测，并用2-ΔΔCt法进行计算分析。通过分析该基因在热胁迫和对照下的表达量的比值，若比值大于等于5，该蓝莓品种可鉴定为耐热品种。该方法相较于田间自然鉴定法更快捷、稳定和准确，是快速筛选耐热品种进行推广种植和耐热新品种育种的基础。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-53, C12N15-11
【公开号】CN104830979
【申请号】CN201510207933
【发明人】陈文荣, 余柯达, 朱心怡, 吴洁慧, 陈晓青
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月28日