用于制备葡聚糖聚合物的葡糖基转移酶的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请要求美国临时申请 61/705, 177 ;61/705, 178 ;61/705, 179 ;61/705, 180 和 61/705, 181的权益，其中每项提交于2012年9月25日。所有这些先前的申请均全文以引 用方式并入本文。
技术领域
[0002] 本发明涉及酶催化领域。具体地，本发明涉及使用葡糖基转移酶制备高分子量、不 溶解的聚a-1，3-葡聚糖。
【背景技术】
[0003] 受到利用微生物或植物宿主的酶合成或基因工程以寻求找到新结构多糖的期望 的驱动，研宄人员已经发现了可生物降解且能够从可再生资源的原料经济地制备的多糖。 一种此类多糖是聚a-1，3-葡聚糖（特征在于具有a-1，3-糖苷键的葡聚糖聚合物）。通 过使鹿糖水性溶液与分离自唾液链球菌（Streptococcussalivarius)的葡糖基转移酶 (gtf)接触已经分离到这种聚合物（Simpson等人，Microbiology141 :1451_1460,1995)。 由聚a-l，3_葡聚糖制备的膜耐受至多150°C的温度并相对于得自0-1，4_连接的多糖的 聚合物具有优点（Ogawa等人，FiberDifferentiationMethods，47 :353_362,1980) 〇
[0004] 美国专利7, 000, 000公开了利用唾液链球菌的gtfj酶制备多糖纤维。在这种聚 合物内至少50 %的己糖单元是通过a-1，3-糖苷键连接的。唾液链球菌的gtfJ酶利用 蔗糖作为聚合反应的底物，从而产生聚a-1，3-葡聚糖和果糖作为终产物（Simpson等人， 1995)。在溶剂或包含溶剂的混合物中溶解超过临界浓度时，本发明所公开的聚合物形成液 晶溶液。从这种溶液得到的连续、强力、棉花状纤维可纺丝并用于纺织应用。
[0005] 并非所有的葡糖基转移酶都能制备适用于纺丝纤维的分子量和a-1，3糖苷键百 分比的葡聚糖。例如，大多数葡糖基转移酶不制备具有至少50%的a-1，3糖苷键和至少 100的数均聚合度的葡聚糖。因此，希望鉴定能够将蔗糖转化为具有高百分比的a-1，3糖 苷键和高分子量的葡聚糖聚合物的葡糖基转移酶。
【发明内容】
[0006] 在一个实施例中，本发明涉及包含水、蔗糖和合成聚a-1，3-葡聚糖的葡糖基转 移酶的反应溶液。所述葡糖基转移酶包含与SEQIDN0:4、SEQIDN0:10、SEQIDN0:12、 SEQIDNO:14、SEQIDNO:20、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、或SEQID NO:34的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。
[0007] 在第二个实施例中，反应溶液中的所述葡糖基转移酶合成具有至少50%的a-1， 3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚a-1，3_葡聚糖。在第三个实施例中，所述葡糖基转 移酶合成具有100%的a-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚a-1，3-葡聚糖。在第 四个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100%的a-1，3糖苷键和至少250的数均聚合 度的聚a-l，3_葡聚糖。
[0008] 在第五个实施例中，所述反应溶液包含引子。在第六个实施例中，这种引子可为右 旋糖酐或水解的葡聚糖。
[0009] 在第七个实施例中，本发明涉及制备聚a-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括使 至少水、蔗糖和合成聚a-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶接触的步骤。所述葡糖基转移酶包 含与SEQIDNO:4、SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 12、SEQIDNO: 14、SEQIDNO:20、SEQID NO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、或SEQIDNO:34 的氨基酸序列至少 90%相同的氨 基酸序列。可任选地分离在这种方法中制备的聚a-1，3-葡聚糖。
[0010] 在第八个实施例中，在这个方法中使用的所述葡糖基转移酶合成具有至少50 %的 a_1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚a-1，3_葡聚糖。在第九个实施例中，所述葡 糖基转移酶合成具有100%的a-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚a-1，3-葡聚 糖。在第十个实施例中，所述葡糖基转移酶合成具有100%的a-1，3糖苷键和至少250的 数均聚合度的聚a-1，3-葡聚糖。
[0011] 在第十一个实施例中，所述方法的接触步骤还包括使引子与水、蔗糖和葡糖基转 移酶接触。在第十二个实施例中，这种引子可为右旋糖酐或水解的葡聚糖。
[0012] 序列简沐
[0013] 表L核酸和蛋白质序列号丨厂总
[0014]
【主权项】
1. 一种包含水、蔗糖和合成聚α -1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的反应溶液，其中所述 葡糖基转移酶包含与 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :14、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、或 SEQ ID N0:34 至少 90%相同的氨 基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶合成具有至少50% α -1， 3糖苷键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。
3. 根据权利要求2所述的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶合成具有100% α -1，3糖 苷键和至少100的数均聚合度的聚α -1，3-葡聚糖。
4. 根据权利要求3所述的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶合成具有100% α -1，3糖 苷键和至少250的数均聚合度的聚α -1，3-葡聚糖。
5. 根据权利要求1所述的反应溶液，所述反应溶液还包含引子。
6. 根据权利要求5所述的反应溶液，其中所述引子为右旋糖酐。
7. 根据权利要求5所述的反应溶液，其中所述引子为水解的葡聚糖。
8. -种用于制备聚α -1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括： a) 使至少水、蔗糖和合成聚α-1，3_葡聚糖的葡糖基转移酶接触，其中所述葡糖基转 移酶包含与 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 12、SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :20、 SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:30、或 SEQ ID N0:34 至少 90%相同的氨基酸序 列；由此制备聚α-1，3-葡聚糖；以及 b) 任选地，分离在步骤（a)中制备的聚α-1，3-葡聚糖。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述葡糖基转移酶合成具有至少50% α -1，3糖 苷键和至少100的数均聚合度的聚α -1，3-葡聚糖。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述葡糖基转移酶合成具有100% α-1，3糖苷 键和至少100的数均聚合度的聚α-1，3-葡聚糖。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述葡糖基转移酶合成具有100% α -1，3糖苷 键和至少250的数均聚合度的聚α -1，3-葡聚糖。
12. 根据权利要求8所述的方法，其中步骤（a)还包括使引子与水、蔗糖和葡糖基转移 酶接触。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述引子为右旋糖酐。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述引子为水解的葡聚糖。
【专利摘要】本文公开了包含水、蔗糖和合成聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的反应溶液。所述葡糖基转移酶能够合成具有至少50％α-1，3糖苷键和至少100的数均聚合度的不溶解的葡聚糖聚合物。还公开了使用此类葡糖基转移酶以制备不溶解的聚α-1，3-葡聚糖的方法。
【IPC分类】C12P19-18, C08B37-00, C12P19-04, C12N9-10
【公开号】CN104838010
【申请号】CN201380049949
【发明人】M.S.帕伊内, Y.布伦, H.何, T.肖兹
【申请人】纳幕尔杜邦公司
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年9月25日
【公告号】CA2884950A1, EP2900828A2, US8871474, US20140087431, US20150004649, US20150004650, US20150004651, US20150004652, US20150004653, US20150010954, US20150010955, US20150010956, WO2014052386A2, WO2014052386A3