一株噬菌体抗性l-天冬氨酸转化菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株具有噬菌体抗性的1-天冬氨酸生产菌，是一种新的菌株品种，属 于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 1-天冬氨酸是一种重要的氨基酸，是生产阿斯巴甜、聚天冬氨酸、1-丙氨酸等化 合物的主要原料，全球年需求量约30万吨，市场需求巨大（Lee KM, et al. J Org Chem. 1989，54:3195 - 3198)。微生物转化法利用产1-天冬氨酸酶的菌种转化富马酸铵生产 1-天冬氨酸，与物理或者化学生产方法相比，具有反应条件温和、转化率高、副产物少等优 点，是目前广泛使用的规模化生产方法(盛晓燕，等?食品科技? 2010，35:23 - 26.)。
[0003] 微生物工业规模生产1-天冬氨酸中的噬菌体污染是一个常见现象，容易造成发 酵周期的延长，发酵底物消耗和产物形成变慢，影响发酵产品的产量和质量，甚至造成发酵 的中止导致发酵失败，给生产造成巨大损失，成为制约产品产能稳定和品质提升的关键因 素之一(孙文敬，等?食品科技? 2013，38:323 - 327;周海岩，等?食品与发酵工业. 2013，39:88 - 93)。选育噬菌体抗性的生产菌种是解决这一问题的有效途径之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种新的菌株品种，具有噬菌体CICC 80001抗性，且可以产 1-天冬氨酸酶，转化富马酸生产1-天冬氨酸。
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一株大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S，该菌株 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC No. 9850。该菌种具有对噬菌体 CICC 80001的抗性。噬菌体CICC 80001可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买获 取。
[0006] 所述抗噬菌体1-天冬氨酸生产菌种，其优选培养基组成为： (1)种子培养基 LB培养基（g/L):酵母粉5.0,蛋白胨10.0,氯化钠10.0, pH 7.0 - 7.2,固体培养基 添加2%的琼脂粉。
[0007](2)发酵培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（g/L):玉米浆干粉13.0,硫酸镁0.2,磷酸二氢钾1.0,氯化钠 1.5,富马酸 5.0,葡萄糖 5.0，pH 6.5 - 7.0。
[0008] 所述具有1-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其活化方法为： 用接种环从大肠埃希氏菌菌种CICC 11021S斜面刮取少量菌种，接入装有100 mL LB 培养基的500 mL三角瓶中，37°C，200 rpm条件下培养8 - 16小时，获得种子液。
[0009] 所述具有1-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其发酵罐培养方法为： 将种子液以1%。_ 5%的接种量接入5 L发酵罐中，发酵培养基体积为2.0 - 4.0 L， 通气量0.5 - 1.5 vvm，搅拌转速为200 - 500 rpm，培养8 - 16小时。
[0010] 所述具有1-天冬氨酸酶活力且抗噬菌体的菌种，其1-天冬氨酸转化罐转化生产 方法为： 配置富马酸溶液，用氨水调节pH，至转化体系富马酸终浓度为0.8 - 1.2 M，pH为7. 7 -8.0,加入发酵液。40 - 50°C，搅拌转速30 - 100 rpm，转化8 - 16小时。转化生成 的1-天冬氨酸经脱色、过滤、结晶、干燥得成品。1-天冬氨酸测定方法采用氨基酸常用测定 方法--高效液相色谱（High performance liquid chromatography, HPLC)柱前衍生方法 (Hender Jff, et al. , Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000)。
[0011] 有益效果： 本发明提供一株具有噬菌体抗性的1-天冬氨酸生产菌种，与之前的1-天冬氨酸生产 菌种相比，可以有效抵抗噬菌体CICC 80001的污染，并且细胞生长速率良好，遗传稳定性 好，有效提高了 1-天冬氨酸生产企业的经济效益。
[0012] 微生物保藏信息 微生物分类命名：大肠埃希氏菌（ikcAericAia coJ7) 保藏编号：CGMCC No. 9850 保藏日期：2014年10月27日； 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮编100101。【具体实施方式】
[0013] 下面通过实施例进一步阐明本发明，但不限于此。
[0014] 实施例一 噬菌体CICC 80001的分离纯化 菌种：前期筛选的卜天冬氨酸转化生产菌种大肠埃希氏菌HY-05C (专利号 CN201110382584. X)〇
[0015] 取受噬菌体污染的大肠埃希氏菌转化液10 ml，6, 000 rpm离心10分钟，取上清液 经0.22 ym微孔滤膜过滤除菌，取200 yl接入装有5 ml上层LB培养基的试管中，同时加 入HY-05C菌悬液200 y 1，混匀，倒入已凝固的LB平板上，铺匀，置37°C培养箱培养18 -24小时。用接种针穿刺培养法挑取形态和大小不一的单个噬菌斑，分别接入含有HY-05C 的液体LB培养基中，37°C，200 rpm培养18 - 24小时。重复上述操作进行噬菌斑形态和 大小的检验，直至得到形态和大小均一的纯化噬菌体。噬菌体CICC 80001保藏于中国工业 微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 80001。目前噬菌体CICC 80001可从中国工业 微生物菌种保藏管理中心购买获得。
[0016] 噬菌体分离纯化培养基：LB培养基(酵母粉5. 0 g/L，蛋白胨10. 0 g/L，氯化钠 10. 0 g/L，pH 7. 0 - 7. 2,上层琼脂 0? 8%，下层琼脂 2%)。
[0017] 实施例二 在添加噬菌体CICC 80001裂解液的条件下，大肠埃希氏菌CICC 11021S与无噬菌体抗 性大肠埃希氏菌HY-05C对照组转化富马酸生产1-天冬氨酸能力的对比验证。
[0018] 优选培养基组成为： (1)种子培养基 LB培养基：酵母粉5. 0 g/L，蛋白胨10. 0 g/L，氯化钠10. 0 g/L，pH 7. 0 - 7. 2,固体 培养基添加2%的琼脂粉。
[0019] (2)发酵培养基 牛肉膏蛋白胨培养基（g/L):玉米浆干粉13.0,硫酸镁0.2,磷酸二氢钾1.0,氯化钠 1.5,富马酸5.0,葡萄糖5.0,用氨水调pH至6. 5 - 7.0。
[0020] 菌种活化方法为：用接种环从大肠埃希氏菌菌种HY-05C或者CICC 11021S斜面刮 取少量菌种，接入装有100 mL LB培养基的500 mL三角瓶中，37°C，200 rpm条件下培养8 -16小时，获得种子液。
[0021] 发酵罐培养方法为：将种子液以1%。- 5%接种量接入5 L发酵罐中，发酵培养基 体积为2.0 - 4.0 L，通气量0.5 - 1.5 vvm，搅拌转速为200 - 500 rpm，培养8 - 16 小时，平行实验发酵罐在接种种子液的同时加入CICC 80001噬菌体裂解液50 ml。
[0022] 1-天冬氨酸转化生产方法为：将发酵罐培养的发酵液转入20 L转化罐，加入终浓 度为0.8 - 1.2 M用氨水调节pH为7. 7 - 8.0的富马酸水溶液。40 - 50°C，搅拌转速 30 - 100 rpm，转化8 - 16小时。加入CICC 80001噬菌体裂解液和不加裂解液的转化 体系作为对照。结果见表1。
[0023] 表1菌种HY-05C和CICC 11021S
【主权项】
1. 一株大肠埃希氏菌coJ7)CICC11021S，其特征在于，该菌株具有大 肠埃希氏菌菌体CICC80001的抗性。
2. 该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCCNo. 9850。
3. 根据权利要求1所述的大肠埃希氏菌CICC11021S，其特征还在于，该菌株可以产 1-天冬氨酸酶，转化富马酸生产1-天冬氨酸。
4. 根据权利要求1所述大肠埃希氏菌CICC11021S，其特征在于，当环境中存在噬菌 体CICC80001时，大肠埃希氏菌CICC11021S可以有效抵抗噬菌体侵染，1-天冬氨酸转化 生产过程不受影响。
5. 利用权利要求1 - 3任一项所述大肠埃希氏菌CICC11021S生产1-天冬氨酸的方 法，其特征包括以下步骤： (1) 将大肠埃希氏菌CICC11021S斜面菌种接种种子培养基，30 - 40°C发酵培养18-24h，得接种液； (2) 接种液接入发酵培养基，发酵10-20h得发酵液； (3) 发酵液转入pH7. 0 - 9. 0的0? 8 -L2mol/L富马酸溶液，控制温度35 - 50°C， 搅拌转速30 - 80rpm，转化6 - 12h，得转化液，转化液经脱色、过滤、结晶、干燥，获得 1-天冬氨酸成品。
【专利摘要】本发明涉及一株大肠埃希氏菌CICC 11021S（Escherichia coli CICC 11021S），具有噬菌体CICC 80001抗性，且具有l-天冬氨酸酶活力，可以转化富马酸生产l-天冬氨酸。本发明的有益效果是大肠埃希氏菌CICC 11021S，可以有效抵抗噬菌体CICC 80001的污染，并且细胞生长速率良好，有效提高了l-天冬氨酸生产企业的经济效益。CGMCC No.985020141027
【IPC分类】C12R1-19, C12P13-20, C12N1-20
【公开号】CN104845921
【申请号】CN201510324836
【发明人】程池, 马玉岳, 徐友强, 刘勇, 裴疆森, 姚粟, 李金霞, 姜增妍, 张京涛
【申请人】中国食品发酵工业研究院, 烟台恒源生物股份有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年6月15日