一种制备(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种制备（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲 基-3-羟基丁酸甲酯的方法。
【背景技术】
[0002] (2S，3R)-2_苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯是一种具有光学活性的羟基酯类 物质，也是手性醇的一种，其化学结构式如式（II)所示。（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟 基丁酸甲酯是合成（3R，4R)-3-[(R)-1-叔丁基二甲基硅氧乙基]-4-乙酰氧基-2-氮杂环 丁酮（简称为4-AA，化学结构式如式（III)所示）的关键起始原料，4-AA是一种重要的医 药精细化学品，主要用于合成各类培南类的抗生素，如亚胺培南、比阿培南、美罗培南和法 罗培南等。这些药物用途广泛，对革兰阴性和阳性菌、需氧菌、厌氧菌等均具有广谱强效抗 菌作用，因而受到人们极大重视。目前，在4-AA的合成工艺方面，以外消旋的2-苯甲酰氨 甲基-3-羰基丁酸甲酯为原料的合成路线是相对较为优越的，因此，如何通过反应高选择 性地建立手性中心是反应过程的关键所在。
【主权项】
1. 一种制备（2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的方法，其特征在于，包括： (1) 制备含羰基还原酶基因的工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌； (2) 分别制备两种工程菌的静息细胞悬液； (3) 将两种静息细胞悬液混合后，再与底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯、 氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得（2S，3R) -2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸 甲酯； 所述羰基还原酶基因的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，所述葡萄糖脱氢酶基因的碱基 序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的工程菌含有表达载体pET-30a (+)，宿 主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氢供体为葡萄糖，所述的辅因子为 NADPVNADPHo
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，两种静息细胞悬液的混合液中，含羰基还原 酶的静息细胞与含葡萄糖脱氢酶的静息细胞的质量比为4 : 1~1 : 2。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，不对称还原反应中，所述底物浓度为2. 5~ 500g/L，含羰基还原酶的静息细胞的浓度为0. lgTS /L~25gTS /L，含葡萄糖脱氢酶的静息 细胞的浓度为〇? Ig干H /L~25g干J1 /L，氢供体的浓度为5~750g/L，辅因子的浓度为0~ 0? 5mM〇
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述不对称还原反应的温度为25~40°C， 反应缓冲液pH为6.0~8.0。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，静息细胞悬液的制备方法，包括：将所述的 工程菌接种到含卡纳霉素的培养基中，摇床活化后，扩大培养至0D600值达到0. 8~1. 2 时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得所述的静息细胞悬液。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为 0. 5 ~0. 8mM。
【专利摘要】本发明公开了一种制备(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的方法，该方法包括：制备含羰基还原酶基因的工程菌和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌；分别制备两种工程菌的静息细胞悬液；将两种静息细胞悬液混合后，再与底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，制得(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯；羰基还原酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述葡萄糖脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。该方法可催化底物外消旋2-苯甲酰氨甲基-3-羰基丁酸甲酯反应生成(2S，3R)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯，提高了产物的转化率和纯度。
【IPC分类】C12R1-19, C12P13-02
【公开号】CN104846025
【申请号】CN201510149171
【发明人】吴坚平, 徐佳, 李洪明, 黄光东, 徐丹萍, 龚伟中, 徐刚, 杨立荣
【申请人】浙江大学, 浙江海翔药业股份有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年3月31日