一种利用超声波处理提取河豚鱼dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 动植物材料样品通常采用细胞裂解缓冲液（CTAB、GuSCN或SDS)在65 °C恒温下 振荡温育，进行样品前处理，继而提取DNA，但要想提取的DNA产量高质量好，必须对动植物 材料样品在裂解缓冲液温育浸泡较长时间，充分反应，比较费时，通常需要过夜，达不到快 速的目的。超声波处理能改善对生物DNA提取效果，提高产量与纯度，但在超声波环境中以 CTAB裂解缓冲液65°C温育提取河豚鱼DNA，迄今未见报道。
[0003] 为提高DNA提取效率，在保证检测结果准确的前提下，缩短DNA提取时间，本发明 以河豚鱼肉为实验材料，对影响河豚鱼特异物种成分（分i B基因)检测的主要前处理因素， DNA提取过程中的CTAB (十六烷基三甲基溴化按，hexadecyltrimethylammonium bromide) 裂解缓冲液在65 °C恒温常规温育与超声波温育处理效果进行比较分析，以期筛选出优化 的前处理措施，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，为建立河豚鱼物种鉴 别的快速检测方法提供依据。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，发明基于超 声波技术的应用，建立一种应用超声波处理的河豚鱼DNA提取方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，所述方法步骤包括如下： 1)合成引物对；所述引物对为 HT-IF :5' -TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3' ；HT-1R : 5,-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3, 。
[0006] 2)河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65 °C 恒温温浴处理，处理时间为5 -25 min，各处理重复3次； 3)将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。
[0007] 步骤2)具体为：称取100 mg样品于2. 0 mL离心管中，加入600 μ L 2 % CTAB溶 液和蛋白酶K 15 μ L，在超声波清洗器中温育处理5 -25 min及在水浴锅中65°C常规温浴 过夜处理；在离心管中加入600 μ L三氯甲烧，13400 r ^mirT1条件下离心15 min，取上清， 加入2倍体积的0. 5 % CTAB溶液，颠倒混勾，室温静置约I. 5 h ;在13400 r WirT1条件下 离心25 min，取沉淀，加入400 yL NaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yL Rnase酶37 °C条件下温浴约I. 5 h ;加入等体积的三氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，颠倒数次充分混合 后，在13400 r · rnirT1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和 1/10体积的NaAc溶液，祸旋30 s，充分混合后，在13400 r ?mirT1下离心15 min ;取沉淀， 加入400 μ L 70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 I-Iiiirr1条件下离心洗涤 沉淀10 min;经DNA浓缩仪干燥10 min，加 pH 8.0、100 μ L TE在65 °C条件下溶解15 min，放入4 °C冰箱保存待用。
[0008] 所述的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇体积比为25 :24 :1。
[0009] 本发明设计5个时间段的超声波处理与常规温育过夜（8小时)处理。其中5个超 声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min，均为65 °C恒温温浴处理，个 处理重复3次。数控超声波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ)使用功率为100%。选择在 超声波清洗器中温育处理5 min，建立了省时高效的超声波处理DNA提取方法。
[0010] 本发明的优点在于：传统的DNA提取过程中的样品CTAB裂解液65 °C恒温常规 温浴处理时间在1-8小时，本方法利用超声波处理65 °C温育只需5 min，节省时间，大幅度 提尚DNA提取效率，进而达到快速检测的目的。
【附图说明】
[0011] 图1不同超声波处理时间提取的河豚鱼DNA电泳结果比较。1-5 :超声波处理 时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min;6:经65 °C常规温浴过夜处理，M: DNA-Marker0
[0012] 图2 6种处理提取的DNA河豚鱼特异物种成分（Cyt B基因)PCR产物电泳图。1-5 : 超声波处理时间依次为5 min、10 min、15 min、20 min、25 min;6:经65 °C常规温浴过夜处 理；7 :非河豚鱼阴性对照；8 :空白（纯水）对照；9 :DNA-Marker。
【具体实施方式】
[0013] 试剂来源与超声波清洗器：10 X T^buffer与7^S|、dNTPs购自上海生工有限 公司。数控超声波清洗器（KQ-500DE型，500 W、40KHZ)购自昆山市超声仪器有限公司。
[0014] 引物合成 由上海生工生物工程有限公司合成河豚鱼成分检测引物（HT-1)，引物碱基序列、PCR 产物片段长度与适合的退火温度（^值）见下表。
[0015] 河豚鱼成分的PCR检测用的引物序列与退火温度
【主权项】
1. 一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于：所述方法步骤包括如 下： 1) 合成引物对； 2) 河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65 °C恒 温温浴处理，处理时间为5 -25 min，各处理重复3次； 3) 将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。
2. 根据权利要求2所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于： 所述引物对为HT-IF:5'-TGCCTCAACTACAAGAACCTAATGG-3'；HT-lR: 5,-GGGAAGGACATAGCCCACGA-3, 。
3. 根据权利要求2所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于： 步骤2)具体为：称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入600 yL 2 % CTAB溶液和 蛋白酶K 15 yL，在超声波清洗器中温育处理5 -25 min及在水浴锅中65°C常规温浴过夜 处理；在离心管中加入600 y L三氯甲烧，13400 r ^mirT1条件下离心15 min，取上清，加入 2倍体积的0. 5 % CTAB溶液，颠倒混匀，室温静置约I. 5 h ;在13400 r ? HiirT1条件下离心 25 min，取沉淀，加入400 yL NaCl溶液，沉淀溶解完全后，加入15 yL Rnase酶37 °C条 件下温浴约1.5 h;加入等体积的三氯甲烷、饱和酚、异戊醇混合液，颠倒数次充分混合后， 在13400 r ?mirT1条件下离心15 min，重复此操作三次；取上清，加入0. 8倍异丙醇和1/10 体积的NaAc溶液，祸旋30 s，充分混合后，在13400 r ? rnirT1下离心15 min ;取沉淀，加入 400 y L 70 %乙醇，上下颠倒使沉淀悬于溶液中，在13400 条件下离心洗涤沉淀 10 min;经DNA浓缩仪干燥10 min，加pH 8.0、100 yL TE在65 °C条件下溶解15 min，放 入4 °C冰箱保存待用。
4. 根据权利要求3所述的一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，其特征在于： 所述的三氯甲烷：饱和酚：异戊醇体积比为25 :24 :1。
【专利摘要】本发明涉及一种利用超声波处理提取河豚鱼DNA的方法，所述方法为：1）合成引物对；2）河豚鱼DNA样品中加入CTAB裂解缓冲液，在功率100%的超声波清洗器中65℃恒温温浴处理，处理时间为5-25 min，各处理重复3次；3）将获得DNA样品用于PCR扩增，通过PCR产物电泳图谱，鉴定处理的DNA提取结果。本发明以河豚鱼肉为实验材料，对影响河豚鱼特异物种成分检测的主要前处理因素，DNA提取过程中的CTAB裂解缓冲液在65℃恒温常规温育与超声波温育处理效果进行分析，以期筛选出优化的前处理措施，提高河豚鱼物种PCR鉴别效率，并保证结果的准确性，为建立河豚鱼物种鉴别的快速检测方法提供依据。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104862303
【申请号】CN201510286408
【发明人】陈文炳, 翁国柱, 邵碧英, 缪婷玉, 江树勋, 彭娟
【申请人】福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月30日