水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高种子活力上的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用技术领域，具体涉及水稻 促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75在提高种子活力上的应用。
【背景技术】
[0002] 自然界的植物是一个有固着的多细胞有机体，它不能像动物一样通过移动来摆脱 不利的环境条件。因此自然界的植物面临各种各样的生存压力，如干旱、高盐以及温度变化 等等，而外界环境的不断变化会对植物的生长发育产生一定的影响。MPK家族在植物的胁 迫应答中介导了非常复杂的信号通路，使植物在面对变化莫测的环境条件时，及时地做出 调节，以便更好的适应环境的改变。
[0003] 当植物暴露于高浓度盐的土壤中时，就会发生盐胁迫，它会对植物的的生长和发 育产生严重的影响，特别是一些农业作物的产量。盐胁迫对植物产生的毒害主要有两个方 面的原因：一是土壤中高浓度的盐使得植物根对水的吸收变得困难；二是植物中高浓度的 盐会导致植物中毒。世界上的植物，除了少数耐盐植物外，大多数植物都不能忍受高盐的胁 迫。植物应对盐胁迫主要是通过盐分过于敏感I (salinity overly sensitive I，S0S1) Na+/H+逆向转运蛋白、HKT转运蛋白和液泡膜上的NHXl逆向转运蛋白，来降低细胞内Na+的 浓度。在高盐和高渗的早期会触发细胞内一系列的信号通路，包括ROS的形成，诱导由PLD 介导的憐脂酸的广生，细胞质内Ca2+浓度瞬时升尚和NO的积累。尚盐和尚渗可以激发许多 MAPK家族的成员。在拟南芥中，高盐和高渗可以快速的激活MKKK20,而MKKK20处于MPK6 的上游，它可以激活MPK6。在高盐高渗早期MPK6可以迅速的磷酸化SOSl Na+/H+逆向转运 蛋白，降低细胞内的Na+。此外，就长期来说，MPK6还可以通过磷酸化锌指转录因子ZAT6来 调节高盐诱导的应答基因的表达。在拟南芥中存在MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4的MPK信号通 路，突变体表现了对盐的耐受性，因此相对MKKK20对盐胁迫的正调控而言，MEKKl可 能是盐胁迫的一个负调控因子。此外，拟南芥的MKK9和MPK3,苜蓿的SMK，烟草的SIPK，玉 米的ZmMPK3、ZmMAPK5和ZmSMKl以及棉花的GhMPK7等均参与了盐胁迫的应答。
[0004] 在水稻中，17个MPK家族成员根据特征基序和序列的特征，可以分别划分为TDY、 TEY两大类和7大组，其中A组包含了 OsMAPKI和0sMAPK5 ;B组包括了 0sMAPK2和0sMAPK2 ; C 组包括了 0sMAPK3 和 OsMAPM ;D 组成员有 0sMAPK7、0sMAPK8、0sMAPK9 和 OsMAPKIO ;E 组 包括了 0sMAPK13、0sMAPK14、0sMAPK15 和 0sMAPK16 ;F 组只有 0sMAPK17。
[0005] 已有的报道表达表明，水稻MAPK在植物各个组织器官中均有表达。已有的报道表 明，绝大部分的MPK都参与了水稻的非生物胁迫应答，包括干旱、高盐、低温/高温、氧化应 激以及重金属胁迫等。如，水稻0sMAPK5，它是水稻比较特殊的MPK基因，它参与了几乎所 有的非生物胁迫应答反应，包括干旱、高盐、臭氧、UV-C射线、重金属和温度变化等。此外， 水稻的 0sMKKl-0sMPK4、0sMPK3、0sMKK4-0sMPK6 以及 0sMKKl、4、6 和 10-2 等都参与 了水稻 的胁迫应答过程。
[0006] 水稻是世界上重要的粮食作物，而种子是农业生产的根本。种子的活力对于植物 繁殖、作物产量、种质资源保存和生物多样性起着决定性的影响。在逆境条件下，高质量的 种子仍能够保持高的萌发率和长出健壮的幼苗。但是，在萌发时对逆境变得越来越敏感，最 终不能萌发。
[0007] 鉴于以上所述，本发明成功克隆了水稻基因的全长，通过构建水稻 的过表达载体，转化模式植物拟南芥，结果表明转基因拟南芥种子比野生型拟南芥 种子具有更强的在氯化钠胁迫下的萌发活力。可以用于植物的遗传转化，提高植物 种子的萌发活力。对于水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75的功能尚未见相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明解决的技术问题是提供了一种水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 在提高种子活力上的应用。
[0009] 本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 在提高种子活力上的应用，其特征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 的核苷序列如SEQ ID N0:1所示，大小为1497bp。
[0010] 进一步限定，所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75应用于提高植物种 子在盐胁迫下的萌发活力，所述的植物为拟南芥、水稻、玉米、大豆或小麦。
[0011] 本发明所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高种子活力上的应用，其特征在 于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，大小为498aa。
[0012] 进一步限定，所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶应用于提高植物种子在盐胁迫下 的萌发活力，所述的植物为拟南芥、水稻、玉米、大豆或小麦。
[0013] 本发明所述的提高植物种子盐胁迫下萌发活力的植物表达载体，其特性在于：所 述的植物表达载体转入了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA。
[0014] 进一步限定，所述的植物表达载体的具体构建方法是利用水稻促分裂原活化蛋白 激酶基因你#/%75的CDNA插到植物表达载体pCAMBIA-1302上的启动子下游，构 建成在基因基因的cDNA上游含有启动子的新的植物表达载体，命名为 pCAMBIA-1302-0sMPK15。通过花序侵染法转化模式植物拟南芥，成功获得转基因植株，继续 培养直到获得T3代的转基因纯合子，将转基因纯合子种子和野生型种子在含有150mM的氯 化钠的MS固体培养基上萌发，结果显示转基因种子的萌发速度和最终萌发率都明显高于 对照的野生型种子，表明水稻促分裂原活化蛋白激酶基因够有效提高植物种子 在盐胁迫下的萌发活力。
[0015] 本发明所述的携带有水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的植物表达载体 pCAMBIA-1302-0sMPK15能够通过使用Ti质粒、Ri质粒或植物病毒载体直接DNA转化、微注 射或电穿孔导入到植物细胞。
[0016] 本发明的有益效果为：从水稻中分离到的促分裂原活化蛋白激酶基因 通过转化模式植物拟南芥证实了能够有效提高植物种子在盐胁迫下的萌发活力；将水稻促 分裂原活化蛋白激酶基因你#/%7辟专入到水稻、玉米、大豆或小麦等重要农作物中，能够提 高重要农作物种子在盐胁迫下的活力，其应用可降低全球每年因盐胁迫而造成的巨大农业 损失，具有重要的经济效益和应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明含水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的植物表达载体的构建 模型，图2是盐胁迫下转基因拟南芥与野生型拟南芥的表型对比图，其中A为150mM NaCl、 B 为 200mM NaCl、C 为 300mM NaCl。
【具体实施方式】
[0018] 以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本 发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发 明的范围。
[0019] 实施例1水稻促分裂原活化蛋白激酶基因 cDNA编码区的获得 (1)水稻的种植 取日本晴水稻（A L. spp. cv Nipponbare, AA genome)种子若干置 于小烧杯中，用体积分数为75%的酒精消毒30sec，再用无菌水冲洗5-6次，每次冲洗lmin。 用无菌水完全淹没种子，浸泡lh。将种子转移至培养皿中，加入适量的水(不能完全淹没种 子)，28°C黑暗培养2-3d。待种子长出幼芽后，采用人工气候箱进行培养，培养条件为28°C、 光照强度160001x、光照时间为16h/d。
[0020] (2)水稻总RNA的提取和cDNA的制备 TRIzol 方法提取培养的水稻根总 RNA，按照 8 μ L RNA+1 μ L buffer+Ι μ L RNase-free DNaseI (TaKaRa)的体系，等比例扩大消化24 μ L的RNA，37°C处理30min。65°C温浴IOmin 终止消化反应后，以OligodT和Random 6 mers 为引物，利用 PrimeScript? RT Enzyme Mix I 37°C温浴15min，之后85°C 5sec终止反应，合成cDNA第一链。
[0021] (3)水稻因 cDNA编码区的扩增 设计引物从上述制备的水稻根组织的cDNA为模板，克隆因的cDNA编码区。 所用反应体系如下：
【主权项】
1. 水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75在提高种子活力上的应用，其特征在于： 所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因你#/%75的核苷序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根据权利要求1所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因在提高种子活力上 的应用，其特征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因应用于提高植物种 子在盐胁迫下的萌发活力。
3. 根据权利要求2所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶基因在提高种子活力上 的应用，其特征在于：所述的植物为拟南芥、水稻、玉米、大豆或小麦。
4. 水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高种子活力上的应用，其特征在于：所述的水稻促 分裂原活化蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
5. 根据权利要求4所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高种子活力上的应用，其特 征在于：所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶应用于提高植物种子在盐胁迫下的萌发活力。
6. 根据权利要求5所述的水稻促分裂原活化蛋白激酶在提高种子活力上的应用，其特 征在于：所述的植物为拟南芥、水稻、玉米、大豆或小麦。
7. -种提高植物种子盐胁迫下萌发活力的植物表达载体，其特性在于：所述的植物表 达载体转入了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA。
8. -种权利要求7所述的提高植物种子盐胁迫下萌发活力的植物表达载体的构建方 法，其特性在于：利用水稻促分裂原活化蛋白激酶基因的cDNA插到植物表达载 体pCAMBIA-1302上的启动子下游，构建成在基因基因的cDNA上游含有 启动子的新的植物表达载体。
9. 权利要求7所述的提高植物种子盐胁迫下萌发活力的植物表达载体能够通过使用 Ti质粒、Ri质粒或植物病毒载体直接DNA转化、微注射或电穿孔导入到植物细胞。
【专利摘要】本发明公开了水稻促分裂原活化蛋白激酶基因OsMPK15在提高种子活力上的应用，属于促分裂原活化蛋白激酶及其编码基因与应用技术领域。本发明的技术方案要点是通过PCR方法扩增出水稻OsMPK15基因的全长编码区cDNA，构建OsMPK15的过表达载体，提高OsMPK15基因的表达，转化模式植物拟南芥，结果表明在转基因的T3代植株中，转基因拟南芥种子比野生型拟南芥种子具有更强的在氯化钠胁迫下的萌发活力。因此，如果将OsMPK15转入到水稻、玉米、大豆和小麦等重要农作物中，则可能提高重要农作物种子在盐胁迫下的活力。OsMPK15的应用可降低全球每年因盐胁迫而造成的巨大农业损失，具有重要的经济效益和应用前景。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-54, C12N15-82
【公开号】CN104862325
【申请号】CN201510288858
【发明人】梁卫红, 黄俊骏, 杨丹丹, 张静, 石佳, 闫鑫甜, 王高华
【申请人】河南师范大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月1日