Hsa-miR-182基因的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种Hsa-miR-182基因的新用途。
【背景技术】
[0002] 肺癌是最为常见、死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。据 报道，近50年来很多国家的肺癌发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率 均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率第一。肺癌可以分为小细胞肺 癌（small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC)。据统计，约80%的肺癌为NSCLC，它是最为常见的肺癌，主要包括腺癌、鳞状细胞癌、 大细胞未分化癌三大类。
[0003] 治疗NSCLC需要根据肺癌的临床分析进行。在肿瘤发生的I、II、IIIA期，主要以 手术切除为主，对于淋巴转移严重的IV期肿瘤，通常于手术前辅以化疗或放疗。经研宄发 现，术后I期化疗者的生存周期与术后未化疗者的生存周期一致，这意味着术后I期化疗并 不发挥作用；对于II期和IIIA期患者，术后化疗对患者有所伤害，会明显缩短病人的生存 期。手术后，I期患者的5年生存率约70%、II期患者的5年生存率约50%，III期手术或化 放疗联合治疗者的5年生存率为15-30%。而对于IIIB期（已侵犯邻近重要脏器）和IV期 (已有远端转移）的患者将无法进行手术治疗，通常实行化学药物、放射线治疗或者中医中 药治疗，患者的5年生存率仅为7%。
[0004] 对于NSCLC患者的及时治疗能够大大提高病人的生存率，改善病人的健康状况。 有效的早期诊断方法能够进行疾病管理，为高风险疾病患者尽早提供有效的治疗。肺癌的 早期诊断可以通过胸部X射线来了解肺内的异常情况。此外，进行血液常规检查以及痰液 病理细胞检测能够帮助肺癌的诊断。一系列深入的检查，包括支气管镜、纵隔镜、肺组织活 检和胸腔镜等技术也用于肺癌的检查诊断中。然而，NSCLC具有生长分裂缓慢、转移能力强 的特点，这为NSCLC的早期诊断带来了一定难度。在现有生理学诊断方法的基础上，我们需 要寻找其它辅助诊断方法，而生物分子标记是一个值得探索的领域。
[0005] 微小 RNA (microRNA，miRNA)是一类长度约 20 个核苷酸（nucleotide, nt)的内 源性非编码RNA分子，它通过特异靶向信使RNAUessenge RNA，mRNA)，在转录后水平上调 控基因表达。miRNA在很多生物进程中发挥作用，例如控制发育，胚胎生成、细胞分化增殖及 凋亡，目前对多数miRNA的靶基因及功能研宄始终是RNA调控的研宄热点。研宄表明，很多 miRNA在不同肿瘤中异常表达，在肿瘤的发病机制中扮演着重要的角色。miRNA及其靶基因 的功能在肿瘤的发生发展中非常重要，一些miRNA甚至有望成为肿瘤治疗的基因靶点。而 miRNA的表达谱可能成为肿瘤诊断、预后、个性化治疗和疾病分类的潜在生物标记。肺癌中 的miRNA表达一直是研宄的热点之一。
[0006] 越来越多的研宄证明，miRNA不仅在肿瘤组织中表达异常，它还存在于患者的唾 液、血浆、血清和福尔马林固定组织之中。因此，循环miRNA的研宄逐渐成为一个新型热点。 随着人体生理代谢活动的进行，人类血清中也检测出循环miRNA的存在。由于血清易于获 得，检测较为方便，且对病人的伤害较小，血清中miRNA诊断标记的研宄将会对肺癌病人的 诊断、预后、治疗等提供更为便捷的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种Hsa-miR-182基因的异常表达在检测血清中非 小细胞肺癌的应用。
[0008] 本发明的目的之二在于提供一种Hsa-miR-182在制备筛选和诊断血清中非小细 胞肺癌的试剂盒中的应用。
[0009] miRNA的异常表达在肿瘤生理过程中扮演着重要的角色，大量miRNA被证实在 肿瘤病人的组织及血清中异常表达，从组织或血清中获得的miRNA能够作为肺癌(尤其是 NSCLC)的潜在诊断标记。本申请通过solexa测序发现，小鼠诱导肿瘤组织中大量miRNA存 在不同的表达差异，部分miRNA在肿瘤组织中表达上调，这在人类肺癌组织中也得到了验 证，这表明miRNA的表达水平高低可以作为肿瘤组织的诊断标记。
[0010] 同时，本发明还发现，人类血清中有稳定存在的miRNA。血清miRNA的异常表达与 肿瘤的发生程度具有一定联系，因此，一些miRNA可以用作NSCLC病人的血清诊断标志物。
[0011] 因此，本发明之一涉及Hsa-miR-182,该miRNA在小鼠诱导NSCLC组织、人类NSCLC 组织、NSCLC病人血清样本及部分常见肺癌细胞系中表达量发生显著提高，且与肿瘤的分型 和分期具有密切关系，因此可以作为NSCLC的诊断标志。
[0012] 在一个优选实例中，发现Hsa-miR-182在人类NSCLC组织中表达异常。在另一个 优选实例中，发现Hsa-miR-182在NSCLC病人血清中表达量升高，而且其表达量变化与肿瘤 分期具有一定关系。
[0013] 本发明另一涉及一种循环miRNA的抽提方法，该方法能够提高血清中miRNA的抽 提效率及抽提纯度。
[0014] 在一优选实例中，该方法能够获得足够RNA样本，可用于qRT-PCR检测及其它实 验。
[0015] 本发明再一涉及一种NSCLC病人血清中miRNA表达丰度的检测方法。
[0016] 本发明还涉及Hsa-miR-182在筛选治疗和诊断试剂盒中的用途。
[0017] 本发明的实施步骤如下所述： 第一步分别从小鼠正常肺组织和诱导NSCLC组织中提取RNA，逆转录构建二者的cDNA 文库，进行solexa测序，获得二者的miRNA测序结果。
[0018] 第二步，分析测序结果，选择表达差异显著的miRNA，作为候选的检测标记物。
[0019] 第三步，通过多种渠道收集不同病理分期NSCLC肺癌病人血清样品，提取血清中 miRNA，逆转录获得每个病人的血清miRNA文库。
[0020] 第四步，利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)方法，检测候选miRNA在不同血清样本 中的表达水平。
【附图说明】
[0021] 图1为Solexa测序结果。表中所列的是小鼠诱导NSCLC模型中表达差异的部分 miRNAo
[0022] 图2诱导小鼠 NSCLC模型中Mmu-miR-182的表达差异。L822T1是基因型KRAS +/+ 的良性肿瘤，L703T2是基因型LKBryVKRASv+的恶性肿瘤，L903T1为P53 +/KRAS+/+的恶性 肿瘤。
[0023] 图3人常见NSCLC细胞系中Hsa-miR-182的表达差异。其中Beas_2B为人类非肿 瘤性肺上皮细胞系，U6为内参，使用法计算相对表达量，图示为3个重复实验结果。
[0024] 图4人类NSCLC组织中Hsa-miR-182的表达差异。其中每例样品以癌旁为参照， 以U6为内参，使用法计算相对表达量。
[0025] 图5 NSCLC病人血清中Hsa-miR-182的表达情况。Α.正常血清样品（8例）与肿 瘤病人血清（32例）中Hsa-miR-182的表达差异。B.不同分期肿瘤病人血清及正常血清中 Hsa-miR-182的表达差异变化。
[0026] 图中 * /7C 0· 05, ** /7C 0· 01，*** /7C 0· 001。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于 限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子 克隆（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中的所述条件，或按照制造 厂商所建议的条件。
[0028] 实施例一：根据solexa测序结果，选择在NSCLC组织中表达变化明显的miRNA。
[0029] 本发明所用到的KRAS基因突变小鼠 NSCLC模型（L822T1、L703T2、L903T1)和正 常肺癌模型（L1805)由中科院生化细胞所季红斌教授课题组提供。其中L822T1是基因型 KRAS+/+的良性肿瘤，L703T2 是基因型 LKB1+/KRAS+/+的恶性肿瘤，L903T1 为 P53 +/KRAS+/+ 的恶性肿瘤。
[0030] 对正常小鼠的肺组织和诱导癌变的小鼠肺组织分别取样，使用Trizol法提取组 织内总RNA。具体步骤为：以Trizol裂解组织，室温放置5分钟，使组织充分裂解，获得裂 解液；加入氯仿，漩涡震荡15秒，以12000g/4°C离心10分钟；离心之后吸取上层水相并加 入等量异丙醇颠倒混匀，室温放置20分钟；再次以12000g/4°C离心10分钟，弃去上清；加 入75%乙醇洗涤沉淀，2000g/4°C离心3分钟；弃去上清液，室温干燥沉淀5-10分钟。晾干 后以DEPC水溶解沉淀即获得总RNA。
[0031] 其次，对于上述方法获得的总RNA产物，本发明使用Takara公司的One St印 PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Code No. D350A)进行逆转录，构建上述组织的 cDNA文库，以oligo dT为引物进行逆转录，通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需 的 miRNA cDNA 文库。
[0032] 对样品进行Solexa法测序（Solexa测序由华大基因公司完成)。分析测序数据， 结合相关研宄报导，发现部分miRNA在诱导的肿瘤组织中的表达变化明显，可见其与肺癌 的发病机制具有一定关联性，其中部分miRNA可能作为潜在的诊断标记(参见图1)。
[0033] 根据测序结果可见，Mmu-miR-182在拥有不同基因背景的小鼠肿瘤的表达量均有 所提高。根据测序结果可见，Mmu-miR-182在小鼠肺肿瘤模型的表达量较高，表达变化显著。 其中，在无 KRAS突变的L822T1模型中，miR-182的表达量提升了约2倍，而在KRAS突变的 L703T2和L930T1模型中，miR-182的水平则提升了 4倍左右。这意味着miR-182的表达量 不仅与肺癌的发生相关，还可能与肿瘤的恶性程度具有一定联系。
[0034] 实施例二：检测常见肺癌细胞系中miRNA的表达差异 本发明涉及的肺癌细胞系包括：A549、95-D、HCC827、H23、H1299、Spca-I等，其中， A549、HCC827和H23为人非小细胞肺癌细胞，Spca-I为人肺腺癌细胞，H1299为非小细胞肺 癌上皮样细胞，95-D为人高转移性肺癌细胞。本实例以正常肺上皮细胞Beas-2B为参照，同 时培养上述6种肺癌细胞系。细胞培养按照ATCC标准流程进行，分别培养于含10%胎牛血 清的对应培养基中。细胞培养箱保持湿润，维持5% CO2的培养状态，以37 °C培养细胞。
[0035] 当细胞在6cm培养皿中达到约80%密度时，使用实施例一中的Trizol法抽提细胞 RNA，并以 Takara 公司的 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Code No. D350A)逆转录获得上述细胞系的miRNA cDNA模板。本试剂盒可对样品中的miRNA及其它 微小非编码RNA进行Poly (A)加尾反应，从而引入Uni-miR qPCR Primer结合位点，可对样 品中的任意miRNA进行定量PCR反应。具体操作过程如下： 1. 配置如下体系：
【主权项】
1. 一种Hsa-miR-182的异常表达在作为非小细胞肺癌病人肺癌组织miRNA标记的应 用。
2. -种Hsa-miR-182在制备筛选和诊断血清中非小细胞肺癌的试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种Hsa-miR-182基因的新用途。miRNA的表达水平变化与肺癌分期有着一定的关联性。miR-182在NSCLC早期患者的血清中的表达量较其它分期具有显著提升，从而可能成为NSCLC血清检测的潜在标记。其中所公开的为Hsa-miR-182-5p作为肺癌病人血清循环miRNA标记的首次报导，该发明在临床上为肺癌检测提供了一定的应用价值。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104862395
【申请号】CN201510238477
【发明人】金由辛, 袁天蔚, 王德韬, 王强, 夏雨晴, 马中良, 韦嘉励
【申请人】上海大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月12日