一种固定化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种固定化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，属于固定化酶领 域。
【背景技术】
[0002] 大豆具有丰富的必需氨基酸组分，是人和畜禽的优质植物性蛋白源，具有很高的 营养价值，此外，大豆蛋白还具有优越的加工性能如乳化性和起泡性等，以及良好的生理功 能，能降低胆固醇、减少患心脏疾病的危险等。随着大豆蛋白分离技术的改进，大豆蛋白作 为营养性和功能性成分得到了广泛的应用，以大豆蛋白为基础的加工食品是目前食品工业 中增长最快的一类。但是，大豆蛋白也是八大类主要致敏原之一，全球有近〇. 3% -0. 4%的 人口对大豆过敏。研宄发现，约有0. 3%-0. 4%的婴幼儿会对大豆蛋白过敏，而且随着大豆 蛋白制品被广泛使用，成人对大豆蛋白过敏的发病率也在不断地攀升。大豆过敏症状表现 出多种不同形式，常见的包括湿瘆、过敏性皮炎和哮喘等。此外，大豆蛋白作为动物饲料的 主要蛋白源，其致敏成分会损伤动物肠道，不利于动物的生长。
[0003] 大豆蛋白分为15S球蛋白、IlS球蛋白、7S球蛋白和2S球蛋白，其中IlS球蛋 白和7S球蛋白约占大豆蛋白总量的70%。β-伴大豆球蛋白是7S组分的主要成分，由 a '（76kDa)，a (72kDa)和β (52_54kDa)亚基组成的分子量为150kDa的三聚体化合物，约 占大豆蛋白总量的20%-30%。Ogawa等按照致敏能力和蛋白含量，把Gly m Bd 60K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd28K作为主要大?致敏原。Gly m Bd 60K即β-伴大?球蛋白的α 亚基，是一种糖蛋白，可被25%左右的大豆敏感患者的血清识别。Krishnan等发现Gly m Bd 60Κ、α'亚基和β亚基都是能引发大豆过敏反应的潜在致敏原。引起过敏反应的过敏 原阈值水平通常很低，很少量的致敏原就足以引发过敏反应。据报道，大豆致敏原阈值水平 范围一般为0. 0013-500mg。因而，如何有效降解大豆蛋白中的过敏原就成为了一个必须解 决的问题。
[0004] 当前对酶解法降解大豆蛋白过敏原的研宄中利用的酶都集中于商品化的酶，很少 有针对降解大豆过敏原而筛选得到的菌株及其产酶的分离纯化并固定化的研宄。本发明将 能够降解大豆过敏原的蛋白酶进行固定化，改善其热稳定性，使更适于工业运用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的固定化方法，以海藻酸钠 作为载体，利用包埋法将蛋白酶进行固定化。
[0006] 所述方法，具体包括：⑴于4°C下，将蛋白酶活力250-260^111171的蛋白酶酶 液与30g · Γ1海藻酸钠溶液按照体积比1:2混合均匀；（2)将所得溶液，滴加到冰浴的 20g · L4CaCl^液中，形成直径l-2mm的凝胶颗粒；（3)于4°C固定化0. 5-6h后，抽虑收集 凝胶颗粒，并洗涤3次后置于4°C备用。
[0007] 所述蛋白酶来源于一株可降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌，菌株保藏号为CCTCC No. M2012165,分类学命名为 Bacillus sp. BBE201108。
[0008] 所述蛋白酶可降解的过敏原包括：β -伴大豆球蛋白的α亚基和β -伴大豆球蛋 白的α '亚基。
[0009] 本发明还提供一种利用所述固定化蛋白酶降解大豆蛋白过敏原的方法，是将固定 化蛋白酶与10%以下的大豆分离蛋白溶液（Soy protein isolates，SPI)按照每ImL SPI 溶液添加30-500U蛋白酶的比例混合，于20-80°C反应5-30min。
[0010] 所述降解大豆蛋白过敏原的方法，在本发明的一种实施方式中，按照每ImL的1% SPI溶液中添加120U的蛋白酶。
[0011] 所述降解大豆蛋白过敏原的方法，在本发明的一种实施方式中，反应温度为60°C。
[0012] 本发明以海藻酸钠为载体，利用包埋法固定化Bacillus sp.BBE201108蛋白酶。海 藻酸钠是天然多糖碳水化合物，是食品安全级材料。本发明利用海藻酸钠对酶进行固定后， 在较好地保持酶的生物活性的基础上，还提高的酶的最适反应温度。固定化后的蛋白酶的 酶活回收率为63. 42%，固定化后的Bacillus sp. BBE201108蛋白酶较游离酶的最适反应 温度升高了 10°C至60°C，对温度和pH的适应范围均增宽，热稳定性明显提高。理化性质的 改善更有利于该酶在非发酵大豆制品的处理及加工的应用。
【附图说明】
[0013] 图1为固定化蛋白酶对大豆分离蛋白过敏原的降解效果验证，M为marker，C为处 理前的大豆蛋白，S为处理后的大豆蛋白。
[0014] 图2为pH对固定化酶和游离酶的酶活力的影响。
[0015] 图3为温度对固定化酶和游离酶的酶活力的影响。
[0016] 图4为固定化酶和游离酶的温度稳定性。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1蛋白酶酶活测定
[0018] I. L-酪氨酸标准曲线绘制：L_酪氨酸标准溶液按表1配制
[0019] 表 1
【主权项】
1. 一种能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的固定化方法，其特征在于，以海藻酸钠作 为载体，利用包埋法将蛋白酶进行固定化；所述方法，具体包括：⑴于4°C下，将蛋白酶活 力250-260U?mL-1的蛋白酶酶液与30g?L-1海藻酸钠溶液按照体积比1:2混合均匀；（2) 将所得溶液，滴加到冰浴的20g?I^1CaCl2溶液中，形成直径1-2_的凝胶颗粒；（3)于4°C 固定化0. 5-6h后，抽虑收集凝胶颗粒，并洗涤3次后置于4°C备用。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶来源于一株可降解大豆主要 过敏原的芽孢杆菌，菌株保藏编号为CCTCCNo.M2012165。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述过敏原包括：0 -伴大豆球蛋白的a 亚基和(6-伴大豆球蛋白的a'亚基。
4. 根据权利要求1-3任一所述方法得到的固定化蛋白酶。
5. -种应用权利要求4所述固定化蛋白酶降解大豆蛋白过敏原的方法，其特征在于， 是将固定化蛋白酶与10 %以下的大豆分离蛋白溶液按照每ImL溶液添加30-500U固定化蛋 白酶的比例混合，于20-80°C反应5-30min。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，按照每ImL的1 %大豆分离蛋白溶液中添 加120U的蛋白酶进化混合。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应温度为60°C。
【专利摘要】本发明公开了一种固定化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，属于固定化酶领域。本发明利用包埋法固定化能降解大豆蛋白过敏原成分的蛋白酶，固定化后，酶的最适反应温度的提高，pH和温度的适应范围增广，pH和温度的稳定性增强，理化性质的改善更有利于该酶在非发酵大豆制品的处理及加工的应用。
【IPC分类】C12N11-10, C12N9-54
【公开号】CN104877980
【申请号】CN201510247287
【发明人】张娟, 陈坚, 付欧, 堵国成
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月14日