一种人工设计糖基修饰提高酶热稳定性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人工设计糖基修饰提高酶热稳定性的改造方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]酶是由活细胞产生的一种具有特殊催化功能的生物大分子，与化学催化剂相比，它具有高效性和专一性两个明显的优势，已经在食品、医药和精细化工等领域起着越来越重要的作用。然而，天然酶在工业催化条件下由于热稳定性差、容易失活，反应效率下降，因此已经成为酶工程应用的重要瓶颈；另外，在一定范围内提高反应温度可以加快分子扩散运动，提高反应速率，因此提高酶耐热性不仅可以延长酶的使用周期，还可以缩短反应进程。因此，对酶分子进行耐热改造以提高其热稳定性和催化活性，是十分必要的。传统的酶耐热改造方法有化学修饰、分子定向进化以及氨基酸遗传修饰等，但它们存在耗时长、工作量大等问题，限制了酶分子耐热改造的发展。因此，利用酶蛋白生产过程中宿主细胞自身的加工过程对酶分子进行热稳定性改造是一种既经济又温和的方法。
[0003]糖基化是蛋白质翻译后的一种重要的加工过程，对蛋白质的整体构象起修饰作用，并影响着蛋白质的结构和功能。将糖基修饰作为一种工具来调节酶的活性，可以提高蛋白质的刚性、稳定性和酶活。然而，生物体内自发的糖基化随机性较强，许多糖基修饰对酶的热稳定性没有显著提升作用，甚至在某些情况下糖基化还会使酶的耐热性降低，造成糖基化改善酶学性质的效率较低，这是因为随机性的糖基修饰位点可能不是影响酶耐热性的关键位点，对酶学性质的提升有限。因此，通过理性设计在酶分子适当的区域定向引入糖链是糖基化改造酶热稳定性的关键。
[0004]毕赤酵母因具有生长快、遗传操作简单的特点，又能对蛋白质进行复杂的翻译后加工，经其糖基修饰后能获得长度适中的糖链(一般只有8-14个甘露糖残基)，可避免过度糖基化带来的蛋白折叠效率低，因此，认为毕赤酵母是利用糖基修饰来改造酶分子的优秀底盘宿主。通过人工设计糖基化调控酶的耐热性，建立毕赤酵母糖基修饰理性改造酶分子耐热性的方法，将为酶分子稳定性的高效改造提供理论基础和技术支持。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决目前大多数生物催化反应中酶的半衰期短、稳定性差以及蛋白质的储存与实际催化反应条件相矛盾的局限，提供了一种较广谱性的提高酶分子稳定性及抗逆性的改造方法。
[0006]为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种酶分子的改造方法，通过对蛋白一级序列及空间构象进行组合分析，在酶蛋白亚基结合面上以及模体结合面上设计N-糖基化修饰位点，同时结合分子动力学模拟分析糖链在该位点形成特定的糖基发卡和糖基垫片结构，然后利用定点突变在设计位点引入N-糖基化修饰特征增强序列子EAS序列:Phe-X-Asn-Y-Ser/Thr (X为任意一种氨基酸，Y为除Pro外的任意一种氨基酸)，通过毕赤酵母自身的翻译后加工修饰过程对突变后的序列进行识别并进行糖链的加工组装，实现了人工设计糖基修饰提高酶的热稳定性。
[0007]本发明的酶分子热稳定性改造方法，具有以下优点:
[0008]1、采用毕赤酵母作为外源蛋白表达及糖链加工的底盘宿主，利用其体内自身的翻译后修饰加工过程对酶分子进行改造，是一种十分温和的改造方法，基本对酶活无损失；同时与其它改造方法相比，不需要对修饰后的酶分子进行二次纯化，大大简化了酶的制备工艺，降低了成本。
[0009]2、对酶蛋白一级序列及空间构象进行组合分析，同时结合分子动力学的模拟分析，可快速的找到对酶分子构象稳定性起关键作用的部位，在此处设计糖链可最大限度的获得对酶分子改造效果最佳的糖基化修饰位点。
[0010]3、本发明的糖基发卡结构以及糖基垫片结构最大程度的稳固了蛋白亚基间以及亚基内部的空间结构，使酶分子热失活阈值提高了 5 °C。
【附图说明】
[0011]图1是本发明实验例中酶蛋白亚基结合面上的糖基发卡结构分子动力学模拟图；
[0012]图2是本发明实验例中酶蛋白亚基模体结合面上的糖基垫片结构分子动力学模拟图；
[0013]图3是本发明实验例中人工设计糖基修饰突变酶糖苷酶F酶切蛋白电泳图；
[0014]图4是本发明实验例中人工设计糖基修饰提高酶蛋白热稳定性检测图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0016]实施例1:理性设计N-糖基化修饰位点
[0017]1、敲除潜在糖基化位点
[0018]以β-D-葡萄糖醛酸苷酶P⑶S(Genbank注册序列号为EU095019)为验证对象，利用在线软件NetNGlyc对其一级氨基酸序列进行分析，根据糖基化特征识别序列子Asn-X-Ser/Thr找出PGUS的潜在糖基化位点，利用定点突变方法将潜在的糖基化位点N28、N231、N383和N594的氨基酸残基Asn突变为Gln，获得无糖基化修饰位点的突变酶P⑶S-UNο
[0019]2、以P⑶S的晶体解析结构为模板，利用SWISS-MODEL对无糖基化修饰位点的P⑶S-UN进行模拟，采用PyMOL对模拟结果进行展示，并对蛋白局部Loop环的B-Factor值、蛋白表面凹槽尺寸以及关键部位的二级结构信息进行分析，备选糖基化修饰位点。
[0020]3、以来源于PDB数据库中编号为2WAH上的分子Man7GlcNac2为糖链，在备选糖基化修饰位点处利用分子动力学模拟连接糖链，进行200ns糖链与酶分子相互作用与运动轨迹的模拟和计算，最终获得了能在PGUS-UN亚基结合面上形成稳定糖基发卡结构(如图1)的糖基修饰位点35K和在亚基内部模体结合面上形成糖基垫片结构(如图2)的修饰位点206So
[0021]实施例2:毕赤酵母表达具有糖基修饰的酶分子
[0022]1、在实施例1最终确定的糖基修饰位点35K和206S处分别设计N-糖基化识别特征增强序列子EAS序列:Phe-X-Asn-Y-Ser/Thr (X为任意一种氨基酸，Y为除Pro外的任意一种氨基酸)，分别利用定点突变引物进行重叠延伸PCR突变35K和206S处所对应的基因序列，将PCR扩增结果利用EcoRI和NotI进行双酶切，酶切后的片段与具有相同酶切粘性末端的pGAPZ a载体进行连接。
[0023]2、利用BlnI对连接好的环形载体进行线性化处理，获得线性化片段电击转化毕赤酵母GSl 15，转化产物涂布在含有博来霉素抗性筛选和2%的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡萄糖醛酸苷活性筛选平板上，由于pGAPZ a质粒含有博来霉素抗性基因，转化成功的工程菌株在博来霉素抗性平板上生长，又由于5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡萄糖醛酸苷为β -D-葡萄糖醛酸苷酶PGUS特定的显色底物，成功表达PGUS后可使在5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-葡萄糖醛酸苷活性筛选平板上生长的菌落呈现蓝色。
[0024]3、筛选上述蓝色的毕赤酵母重组菌，在含有2%的葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母粉的培养基中30°C摇瓶培养，5天后5000rpm离心5min，取1mL离心上清液加1mL的丙酮进行蛋白沉淀，4°C 12000rpm离心5min用50yL 1mM磷酸缓冲液重悬，对获得的突变酶P⑶S-35K和P⑶S-206S用糖苷酶F进行糖链切除以检测是否成功连接糖链，以糖链切除前后在10%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中酶蛋白的分子量大小发生变化确定是否成功获得相应位点糖基修饰，结果如图3，结果说明在人工设计的糖基修饰位点处经毕赤酵母表达后成功连接上了糖链。
[0025]实施例3:具有糖基修饰酶分子的热稳定性验证
[0026]将实施例2中获得的糖基修饰酶P⑶S-35K和P⑶S-206S置于65°C水浴锅中保温，保温时间分别为30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟，保温后移取1yL酶液加入到40 μ L含有1.25mmol/L 4-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖醛酸苷、pH为4.2的乙酸一乙酸钠缓冲溶液中，40°C条件下反应5分钟后，加入200 μ L、0.4mol/L的碳酸钠终止反应，样液用酶标仪(405nm)检测对硝基苯酚的含量，以测定β _D_葡萄糖醛酸苷酶的相对酶活，从而检测糖基修饰酶分子的热稳定性，结果如图4，结果说明人工设计的糖基发卡结构P⑶S-35K和糖基垫片结构P⑶S-206S显著提高了酶分子的热稳定性。
【主权项】
1.一种人工设计糖基修饰提高酶热稳定性的方法，其特征在于，酶热稳定性的提高是通过在酶蛋白亚基之间形成特定的糖基发卡结构，或在酶蛋白亚基内部模体之间形成特定的糖基垫片结构。2.如权利要求1所述的糖基发卡结构，其特征在于，是通过在酶蛋白亚基结合面上设计N-糖基化修饰位点而引入的糖链；糖基垫片结构，是通过在酶蛋白亚基模体结合面上设计N-糖基化修饰位点而引入糖链。3.如权利要求2所述的N-糖基化修饰位点的设计，其特征在于，对蛋白质一级序列及空间结构进行组合分析，结合分子动力学模拟进行人工设计N-糖基化位点。
【专利摘要】本发明提供了一种人工设计糖基修饰提高酶热稳定性的方法，属于生物工程领域。本发明通过对酶蛋白一级序列及空间结构进行组合分析，在酶蛋白亚基结合面上设计N-糖基化位点，或在其亚基内部模体结合面上设计N-糖基化位点，利用定点突变引入N-糖基化修饰特征识别增强序列子，使糖链在酶蛋白亚基之间形成特定的糖基发卡结构或在酶蛋白亚基内部模体之间形成特定的糖基垫片结构，最大限度的增加了酶蛋白三级结构的刚性，稳定其空间构象免受高温环境的胁迫。本发明的酶蛋白改造方法，大幅度提高了酶蛋白的热稳定性，该方法实现了人工可控的提高酶蛋白的热稳定性，并且在一定程度上提高了酶活，强化了其催化特性。
【IPC分类】C12N9/24, C12N9/96
【公开号】CN104894091
【申请号】CN201510346747
【发明人】李春, 王小艳, 冯旭东, 樊艳爽
【申请人】北京理工大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月19日