一种通过诱导提高活性多糖含量的发菜培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蓝藻提高活性物质培养技术领域，具体的说是一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法。
【背景技术】
[0002]多糖作为生物体主要的天然高分子化合物，广泛存在于高等植物，动物细胞膜和微生物细胞壁中，在生命活动过程中有重要作用。藻类多糖具有抗病毒活性、抗凝血活性、抗肿瘤活性等作用，发菜多糖能阻断病毒对寄主细胞的吸附，阻止病毒在寄主细胞内的复制，对流感病毒、人巨细胞病毒和单纯疱瘆病毒等多种具有封套的病毒均具有抗病毒作用。
[0003]发菜是一种陆生丝状蓝细菌，具有很高的营养价值。发菜多生长在我国西北干旱，半干旱地区，具有强烈的嗜光性，能够在恶劣的自然环境下生存繁殖。本发明利用UV-C紫外照射诱导提高人工液体培养发菜活性多糖含量，为获得更多发菜多糖提供一种有效的途径。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种能够获得更多发菜多糖的通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，该方法包括以下步骤:
1)将活化后的发菜细胞接种于优化后新鲜无菌的含外源N的BG-1l培养基中，于25°C恒温，80 μ mol/mVs光照强度条件下进行培养，备用；
2)取步骤I)培养至对数期的发菜细胞液，分装于直径为90mm的玻璃培养皿中，用保鲜膜封口，然后用醋酸纤维膜滤光；
3)在红灯或黑暗，温度25°C，距离30cm处，强度15W条件下，对步骤2)所述发菜细胞液进行UV-C紫外照射4-14min ；
所述步骤I)中BG-1l培养基由养基与NaNO 3共同优化配制而得。
[0006]本发明的有益效果:
本发明提供的通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，发菜胞外多糖是发菜细胞通过自身对外界环境的应激反应得到的天然代谢物质，保证了天然物质原有的生物活性；本发明涉及的UV-C处理方法操作简便，易于控制，适于大规模培养；本发明培养获得的发菜细胞液中胞外多糖含量丰富，可以作为多种保健品中的功能性食品添加剂。
【附图说明】
[0007]图1本发明实施例1-2所得的发菜细胞液的发菜胞外多糖含量测试结果图。【具体实施方式】
[0008]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步的阐述。
[0009]一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤:
1)将活化后的发菜细胞接种于优化后新鲜无菌的含外源N的BG-1l培养基中，于25°C恒温，80 μ mol/mVs光照强度条件下进行培养，备用；
2)取步骤I)培养至对数期的发菜细胞液，分装于直径为90mm的玻璃培养皿中，用保鲜膜封口，然后用醋酸纤维膜滤光；
3)在红灯或黑暗，温度25°C，距离30cm处，强度15W条件下，对步骤2)所述发菜细胞液进行UV-C紫外照射4-14min ；
所述步骤I)中BG-1l培养基由养基与NaNO 3共同优化配制而得。
[0010]实施例1
一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，包括以下步骤:
1)将活化后的发菜细胞接种于优化后新鲜无菌的含外源N的BG-1l培养基中，于25°C恒温，80 μ mol/mVs光照强度条件下进行培养，备用；
2)取步骤I)培养至对数期的发菜细胞液，分装于直径为90mm的玻璃培养皿中，用保鲜膜封口，然后用醋酸纤维膜滤光；
3)将超净工作台的紫外灯打开，预热lOmin，在红灯或黑暗，温度25°C，距离30cm处，强度15W条件下，对步骤2)所述发菜细胞液进行UV-C紫外照射4min，6min，8min。
[0011]所述发菜细胞以采集于宁夏银川贺兰山东麓的发菜为原材料，经河南科技大学微生物实验室分离、纯化、活化所得。
[0012]所述发菜细胞培养基为由养基与NaNO 3共同优化配制的BG-1l培养基，在此培养基中，发菜细胞具有较高生长速率。
[0013]所述培养基由下列步骤的方法制备:
1.BG-1Itl培养基的制备
(1)称取CaCl22.72g，MgSO4 -1W2Q 7.5g，用蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成母液
A，常温保存备用；
(2)称取H3BO4 286mg，ZnSO4.7H20 20mg，NaMoO4.2H20 40mg，EDTA.2Na 10mg，FeSO4.7H20 480mg，MnCl.4H20 180mg，CuSO4.5H20 8.0 mg, CoCl2 1.0mg，柠檬酸 60mg，蒸馏水溶解后，定容至1000mL，配制成母液B，4°C冰箱冷藏备用；
(3)准确称取Na2S13.9Η20 5.8g，蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成Si液，常温保存备用；
(4)称取K2HPO44g，蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成P液，常温保存备用；
(5)移液管准确吸取A液10mL，B液ImL混合，补足蒸饱水至总体积为500mL，分装于250mL三角瓶中，每瓶50mL，包扎灭菌；
(6)移液管准确吸取Si液1mL和P液1mL混合，补足蒸馏水至总体积500mL，250mL三角瓶分装，每瓶50mL，包扎灭菌；
(7)将灭菌后的(5)和(6)于超净工作台无菌条件下冷却后混合，摇匀，即为配制好的BG-1 Ic^养基。
[0014]注:为防止高温情况下BG-1gt养基中各种物质发生反应产生沉淀，步骤(5)和(6)进行单独灭菌后再混合。
[0015]2.BG-1l培养基的制备
将NaNO3W 1.5g/L的添加量加入步骤(7)中所制P液和Si液的混合液中，共同灭菌所得。
[0016]上述NaNO3的作用主要是为了给发菜细胞生长提供充足的N源。
[0017]实施例2
一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，包括以下步骤:
1)将活化后的发菜细胞接种于优化后新鲜无菌的含外源N的BG-1l培养基中，于25°C恒温，80 μ mol/mVs光照强度条件下进行培养，备用；
2)取步骤I)培养至对数期的发菜细胞液，分装于直径为90mm的玻璃培养皿中，用保鲜膜封口，然后用醋酸纤维膜滤光；
3)将超净工作台的紫外灯打开，预热lOmin，在红灯或黑暗，温度25°C，距离30cm处，强度15W条件下，对步骤2)所述发菜细胞液进行UV-C紫外照射lOmin，12min，14min。
[0018]所述发菜细胞以采集于宁夏银川贺兰山东麓的发菜为原材料，经河南科技大学微生物实验室分离、纯化、活化所得。
[0019]所述发菜细胞培养基为由养基与NaNO 3共同优化配制的BG-1l培养基，在此培养基中，发菜细胞具有较高生长速率。
[0020]所述培养基由下列步骤的方法制备:
1.BG-1Itl培养基的制备
(1)称取CaCl22.72g，MgSO4 -1W2Q 7.5g，用蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成母液
A，常温保存备用；
(2)称取H3BO4 286mg，ZnSO4.7H20 20mg，NaMoO4.2H20 40mg，EDTA.2Na 10mg，FeSO4.7H20 480mg，MnCl.4H20 180mg，CuSO4.5H20 8.0 mg, CoCl2 1.0mg，柠檬酸 60mg，蒸馏水溶解后，定容至1000mL，配制成母液B，4°C冰箱冷藏备用；
(3)准确称取Na2S13.9Η20 5.8g，蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成Si液，常温保存备用；
(4)称取K2HPO44g，蒸馏水溶解后，定容至lOOOmL，配制成P液，常温保存备用；
(5)移液管准确吸取A液10mL，B液ImL混合，补足蒸饱水至总体积为500mL，分装于250mL三角瓶中，每瓶50mL，包扎灭菌；
(6)移液管准确吸取Si液1mL和P液1mL混合，补足蒸馏水至总体积500mL，250mL三角瓶分装，每瓶50mL，包扎灭菌；
(7)将灭菌后的(5)和(6)于超净工作台无菌条件下冷却后混合，摇匀，即为配制好的BG-1 Ic^养基。
[0021]注:为防止高温情况下BG-1gt养基中各种物质发生反应产生沉淀，步骤(5)和
(6)进行单独灭菌后再混合。
[0022]2.BG-1l培养基的制备
将NaNO3W 1.5g/L的添加量加入步骤(7)中所制P液和Si液的混合液中，共同灭菌所得。
[0023]上述NaNO3的作用主要是为了给发菜细胞生长提供充足的N源。
[0024]以下是对实施例1-2所得的发菜细胞液的发菜胞外多糖含量进行测定。
[0025]检测方法:
1、葡萄糖溶液标准曲线的获取。取75 mg葡萄糖，放于烘箱中105°C反复烘干至恒重，用蒸馏水定容至500mL，得到150mg/mL葡萄糖标准溶液，精确吸取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5、
0.6,0.7,0.8mL标准溶液，各以蒸馏水补充至2mL，另取2mL蒸馏水作为空白对照。分别加6%苯酚lmL，浓硫酸5mL，摇匀后沸水浴10 min，冷却至室温。用紫外可见分光光度计于490nm波长下测定其吸光度值，以标准葡萄糖溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标制得标准曲线，Y=0.0075x-0.0011，R2=0.9991。
[0026]2、分别取步骤3)中经过福射处理的发菜细胞液5mL，经4000rpm离心lOmin，取上清液2mL，加入ImL 6%苯酚溶液，5mL浓硫酸，摇匀后沸水浴lOmin，冷却至室温，在490nm处分别测定其吸光度，对照标准曲线计算出胞外多糖含量，并观察其变化趋势。
[0027]所述苯酚为重蒸苯酚，6%苯酚溶液由80%苯酚溶液配制，且保证现配现用。
[0028]实验结果如下图1所示，由图可知，随着照射时间的增长，发菜胞外多糖含量呈现增长趋势。实验结果表明:发明的培养方法能促进发菜细胞分泌多糖，提高发菜多糖产量。
【主权项】
1.一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 1)将活化后的发菜细胞接种于优化后新鲜无菌的含外源N的BG-1l培养基中，于25°C恒温，80 μ mol/mVs光照强度条件下进行培养，备用； 2)取步骤I)培养至对数期的发菜细胞液，分装于直径为90mm的玻璃培养皿中，用保鲜膜封口，然后用醋酸纤维膜滤光； 3)在红灯或黑暗，温度25°C，距离30cm处，强度15W条件下，对步骤2)所述发菜细胞液进行UV-C紫外照射4-14min。2.如权利要求1所述的，其特征在于:所述步骤I)中BG-1l培养基由BG-1lC1培养基与NaNO3共同优化配制而得。
【专利摘要】本发明涉及一种通过诱导提高发菜活性多糖含量的培养方法，发菜胞外多糖是发菜细胞通过自身对外界环境的应激反应得到的天然代谢物质，保证了天然物质原有的生物活性；本发明涉及的UV-C处理方法操作简便，易于控制，适于大规模培养；本发明培养获得的发菜细胞液中胞外多糖含量丰富，可以作为多种保健品中的功能性食品添加剂。
【IPC分类】C12N15/01, C12N13/00, C12R1/01
【公开号】CN104894103
【申请号】CN201510196448
【发明人】郭金英, 李彤辉, 陈秀金, 吴影, 崔国庭, 王萍, 任国艳, 罗登林, 李智利, 李松彪
【申请人】河南科技大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年4月23日