一种高效转染HaCaT细胞的方法
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物领域，具体涉及一种高效转染HaCaT细胞的方法。
【背景技术】
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[0002]HaCaT细胞是由人正常皮肤角质形成细胞衍生出的人皮肤永生化角质形成细胞株，鉴于其容易培养及可以多次传代的优点，它被用来作为一种工具细胞代替研宄人正常角质形成细胞，通过各种药物、化合物、理化因素等对HaCaT细胞的影响来研宄人皮肤角质形成细胞的细胞增值、细胞周期及皮肤病理机制等。
[0003]细胞转染指的是真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。外源基因转染进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法、病毒介导法和脂质体介导法。由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的转染方法多采用脂质体法。阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA —脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过细胞膜上小孔的直接渗透作用将DNA传递进入细胞。
[0004]HaCaT细胞的细胞膜比较厚，难以消化，更难转染，要将外源DNA通过脂质体转染进入HaCaT细胞是一件很困难的事，转染效率非常低，常常达不到实验要求。通过电击法和病毒法进行转染的效率也不高，而且实验操作过程比较麻烦，如何利用简单的脂质体转染法来提高外源DNA转染进入HaCaT细胞成为了一个技术难题。
[0005]聚乙二醇辛基苯基醚(TX-10)是一种非离子型表面活性剂。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是提供一种能大大提高HaCaT细胞的转染效率的高效转染HaCaT细胞的方法。
[0007]本发明的高效转染HaCaT细胞的方法，其特征在于，其是在用脂质体法转染质粒进入HaCaT细胞的过程中，在HaCaT细胞的转染体系中加入聚乙二醇辛基苯基醚(TX-10)。
[0008]优选，所述的聚乙二醇辛基苯基醚(TX-10)在HaCaT细胞的转染体系中的含量为0.005g/100mlo
[0009]本发明与传统的脂质体转染不同的是在转染过程中加入了聚乙二醇辛基苯基醚(TX-10)，它能提高真核细胞膜的通透性，从而促进脂质体-DNA复合物有效的进入细胞，对细胞膜比较厚，难以用传统脂质体法进行转染的HaCaT细胞，这种方法很有效，使得转染效率提高了几倍，它对一些别的细胞膜厚难转染的细胞也有适用性，只是要注意聚乙二醇辛基苯基醚的用量，因为它用量高了对细胞有毒性，用量低了效果不明显。对于HaCaT细胞来说，TX-10的最适用量是0.005% (0.005g/100ml)，在该用量下，HaCaT细胞的细胞死亡率最低，转染效率最高。【附图说明】:
[0010]图1是对照组和实验组的荧光显微镜拍摄图，其中对照表示对照组，+0.005%TX-10表示实验组，使用了明场和暗场两种方式，明场能清晰的看见HaCaT细胞形态，由图中可见，无论是对照组还是+0.005% TX-10组，在明场下，细胞的贴壁都很好，死细胞很少；而暗场只能看到转染成功了的带有GFP绿色荧光蛋白的细胞，由图中可见，在暗场下，+0.005% TX-10组的细胞荧光数要比对照组的要多，荧光强度也比较强，说明在转染时加入0.005%的TX-10可大幅度提高HaCaT细胞的转染率。
[0011]图2是对转染了绿色荧光蛋白GFP的HaCaT细胞提总蛋白，并用抗GFP的抗体进行免疫印迹实验图，其中对照表示对照组，+0.005% TX-10表示实验组，从图中可以发现，在内参一致的情况下(表明细胞数量大致相同)GFP蛋白在对照组中的表达量比在加了0.005% TX-10的实验组的表达量要低很多，证明在转染时加0.005%的TX-10可以有效促进GFP质粒在HaCaT细胞中的转染和表达。
【具体实施方式】
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[0012]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0013]实施例1:
[0014]1、将HaCaT细胞接种于12孔板内，铺板密度约为40_50 %，37 °C培养箱内培养12-24h ；
[0015]2、细胞转染分组:GFP质粒转染组(GFP为绿色荧光蛋白，可根据荧光强度判断转染效率)，0.005% TX-10+GFP质粒转染组。其中前组设为对照组，后组为实验组。
[0016]3、细胞转染步骤:a、用完全培养基(DMEM+10 % FBS)将聚乙二醇辛基苯基醚(TX-10)稀释至0.1% (0.lg/100ml，即每10ml完全培养基中加入0.1g的聚乙二醇辛基苯基醚，混溶)山、取一个1.5ml的EP管，分别加入100 μ I DNA浓缩缓冲液(EC buffer)，3.2 μ I Enhancer 以及 600ng GFP 质粒，静置 5min ;c、加入 10 μ I Effectene，轻轻吹打均匀，静置1min ;d、再加入290 μ I的完全培养基，配成总体积为400 μ I的质粒转染液；e、取出已经铺好HaCaT细胞的12孔板，去原液，在对照组的孔槽内加入800 μ I的完全培养基，而实验组则加入750 μ I的培养基；f、各取200 μ I的质粒转染液，缓慢滴加入相应的孔内，轻轻摇晃均匀；g、在实验组的孔槽内加入步骤a的50 μ I 0.1%的TX-10稀释液，使其终浓度为0.005% (0.005g/100ml)，轻轻摇晃均匀；h、于细胞培养箱内继续培养，4_6h后，将原液吸出，并用PBS洗两次细胞，然后加入Iml完全培养基继续培养。
[0017]4、24h后，可利用荧光显微镜观察实验组和对照组细胞的转染率，并利用数字图像采集系统拍摄图片；还可用免疫印迹的方法来检测GFP蛋白在细胞中的表达量。
[0018]结果如图1和图2所示，从图1可以看出，无论是对照组还是+0.005% TX-10组(实验组)，在明场下，细胞的贴壁都很好，死细胞很少；而暗场只能看到转染成功了的带有GFP绿色荧光蛋白的细胞，由图中可见，在暗场下，+0.005% TX-10组的细胞荧光数要比对照组的要多，荧光强度也比较强，说明在转染时加入0.005%的TX-10可大幅度提高HaCaT细胞的转染率。由图2可以看出，对转染了绿色荧光蛋白GFP的HaCaT细胞提总蛋白，并用抗GFP的抗体进行免疫印迹实验，发现在内参一致的情况下(表明细胞数量大致相同)GFP蛋白在对照组中的表达量比在加了 0.005% TX-10的实验组的表达量要低很多，证明在转染时加0.005%的TX-10可以有效促进GFP质粒在HaCaT细胞中的转染和表达。
【主权项】
1.一种高效转染HaCaT细胞的方法，其特征在于，其是在用脂质体法转染质粒进入HaCaT细胞的过程中，在HaCaT细胞的转染体系中加入聚乙二醇辛基苯基醚。2.根据权利要求1所述的高效转染HaCaT细胞的方法，其特征在于，所述的聚乙二醇辛基苯基醚在HaCaT细胞的转染体系中的含量为0.005g/100ml。
【专利摘要】本发明公开了一种高效转染HaCaT细胞的方法。它是在用脂质体法转染质粒进入HaCaT细胞的过程中，在HaCaT细胞的转染体系中加入TX-10。本发明在转染过程中加入了TX-10，它能提高真核细胞膜的通透性，从而促进脂质体-DNA复合物有效的进入细胞，对细胞膜比较厚，难以用传统脂质体法进行转染的HaCaT细胞，这种方法很有效，使得转染效率提高了几倍，它对一些别的细胞膜厚难转染的细胞也有适用性，只是要注意聚乙二醇辛基苯基醚的用量，因为它用量高了对细胞有毒性，用量低了效果不明显。对于HaCaT细胞来说，TX-10的最适用量是0.005％，在该用量下，HaCaT细胞的细胞死亡率最低，转染效率最高。
【IPC分类】C12N15/88
【公开号】CN104911212
【申请号】CN201510279140
【发明人】李志远, 李彩月, 马文波
【申请人】中国科学院广州生物医药与健康研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月27日